12623 гост: Днища плоские неотбортованные. Основные размеры – РТС-тендер

Чтобы охарактеризовать экспрессию Klf9 в RGL во взрослой зубчатой ​​извилине, мы вывели Klf9 — LacZ мышей-репортеров ( 39 ) с Линия трансгенных мышей Nestin GFP, в которой Nestin + RGL генетически мечены GFP ( 40 ).Количественная оценка экспрессии Klf9 на основе интенсивностей LacZ у мышей Klf9 ^{LacZ / +} выявила обогащение покоящимися RGL относительно активированных RGL (MCM2 +) (однофакторный дисперсионный анализ, F = 17,07, p = 0,003) ( Рисунки 1A-B ). Экспрессия MCM2 захватывает активированные клетки, вышедшие из состояния покоя. Чтобы уточнить эту оценку, основанную на суррогате (LacZ) экспрессии Klf9 в компартменте RGL, мы выполнили флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) с использованием специфического рибозонда Klf9 и иммуногистохимии для GFP и BrdU на полученных срезах гиппокампа взрослых из Klf9 ^{+ / + или LacZ / LacZ} ; Трансгенные мыши Nestin GFP перфузировали через 2 часа после импульса BrdU (односторонний дисперсионный анализ, F = 5.6, p = 0,04) ( Рисунки 1C-E ). Никакого сигнала не было обнаружено с помощью FISH с использованием рибозонда Klf9 на срезах мозга мышей Klf9 ^{LacZ / LacZ} , таким образом передавая специфичность рибозонда ( Рисунок 1D ). Количественная оценка транскриптов Klf9 с использованием изображения J выявила значительно повышенную экспрессию в покоящихся по сравнению с активированными (Brdu + нестин GFP +) RGL ( Фигуры 1C и 1E ).

(AB) Klf9 Экспрессия , выведенная из интенсивности экспрессии LacZ в покоящихся RGL, qRGL (GFP + MCM2 — с радиальным отростком, стрелки) , активированные RGL, aRGL (GFP + MCM2 + с радиальным отростком, наконечники стрелок) и активированные нейронные предшественники, aNPC (GFP + MCM2 + без радиального отростка) в Klf9 ^{LacZ / + или LacZ / LacZ} ; Нестин GFP трансгенный.qRGL демонстрируют более высокую экспрессию Klf9 , чем aRGL и aNPC. n = 3 мыши / группа.

(C-E) Флуоресценция in situ гибридизация с использованием Klf9 специфического рибозонда и иммуногистохимия для GFP и BrdU на срезах гиппокампа взрослых, полученных из Klf9 ^{LacZ / + или LacZ / LacZ} ; Трансгенные мыши Nestin GFP.

(D) Специфичность рибозонда установлена ​​путем обнаружения экспрессии Klf9 в зубчатой ​​извилине мышей Klf9 ^{+ / +} , но не у мышей Klf9 ^{LacZ / LacZ} .(C, E) Klf9 экспрессируется в qRGL, но не в делящихся (BrdU +) RGL или aNPC. n = 3 мыши / группа.

(FG) Индуцируемая делеция Klf9 в Gli1 + RGL у взрослых мышей (Gli1 Cre ^ERT2 : Klf9 ^{+ / +} : Ai14 против Gli1 Cre ^ERT2 : Klf9 ^{f / f} : Ai14) приводит к увеличению активации RGL (процент MCM2 + tdTomato + нестин + RGL). n = 3, 4 мыши / группа.

Данные представлены как среднее ± SEM. * р <0,05, ** р <0.01, **** p <0,0001. Масштабная шкала Рисунков 1B, 1F: 50 мкм, Рисунок 1D 250 мкм, Рисунок 1E 20 мкм.

См. Также соответствующие дополнительные рисунки 1 и 2.

Далее мы спросили, что происходит, когда мы удаляем Klf9 из взрослых гиппокампальных RGL. Чтобы ответить на этот вопрос, мы сконструировали условно-мутантных мышей Klf9 ( Klf9 ^{f / f} ) для автономного удаления Klf9 в RGL. Сначала мы проверили нашу линию мышей Klf9 ^{f / f} , скрестив ее с линией мышей POMC-Cre, которая управляет рекомбинацией в зубчатой ​​извилине.ISH на срезах гиппокампа из POMC-Cre: Klf9 ^{f / f} выявил экспрессию соли и перца Klf9 в зубчатой ​​извилине в соответствии с установленным паттерном зависимой от POMC-Cre рекомбинации в зубчатой ​​извилине ( 41 ) . Никакого сигнала не было обнаружено при гибридизации in situ с использованием рибозонда Klf9 на срезах мозга мышей Klf9 ^{LacZ / LacZ} , что свидетельствует о специфичности рибозонда ( Фигуры S1A-C ).Мы вывели мышей Klf9 ^{f / f} с (член семейства GLI-Kruppel 1) Gli1 Cre ^ERT2 для рекомбинации Klf9 (делеция экзона 1) в гиппокампальных RGL ( Фигуры 1F-G ). Мы выбрали драйверную линию Gli1 Cre ^ERT2 , потому что популяционное отслеживание клонов и хроническая визуализация in vivo предполагает, что меченные Gli1Cre ^ERT2 RGL способствуют долгосрочному обслуживанию и самообновлению ( 3, 42 ). Затем мы сгенерировали Klf9 ^{f / f или + / +} мышей, несущих аллель Gli1 Cre ^ERT2 и аллель Cre-репортер (Ai14, B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor ^{tm14 (CAG- tdTomato) Hze} / J) ( 43 ) для несмываемой метки Gli1-положительных RGL и их потомков ( Рисунок 1F) .Мы индуцировали рекомбинацию Klf9 и экспрессию tdTomato в RGL взрослых (2 месяца) Gli1 Cre ^ERT2 ; Klf9 ^{ф / ф или + / +} ; Мышей Ai14 и обработанные срезы мозга для иммуногистохимии Nestin, tdTomato и MCM2 через 7 дней после инъекции (7 точек на дюйм) для количественного определения активированных RGL ( Фигуры 1F-G ). Мы обнаружили, что условная делеция Klf9 в Gli1 Cre ^ERT2 нацелена на взрослые RGL гиппокампа, значительно увеличивая долю активированных RGL (% MCM2 + tdTomato + RGL) ( Рисунок 1G ) (Непарные t-тесты, Рисунок 1G p = 0.02, рисунок 1I p <0,0001). Дополняя эти результаты, мы продемонстрировали, что генетическая сверхэкспрессия Klf9 в активированных нейральных стволовых клетках гиппокампа и предшественниках взрослого Sox1 tTA; У мышей teto Klf9 ( 38, 44 ) значительно уменьшалась фракция активированных и делящихся клеток ( Фигуры S2A-D ). Вместе эти данные демонстрируют, что экспрессия Klf9 обогащена в покоящихся RGL и что потеря экспрессии Klf9 в RGL либо способствует, либо поддерживает активированное состояние RGL в гиппокампе взрослых.

Далее мы спросили, как потеря функции Klf9 в RGL влияет на режим самообновления деления. Эксперименты по отслеживанию клонов на уровне популяции в краткосрочные моменты времени преследования показали, что потеря Klf9 в Gli1 + RGLs увеличивает количество RGL (данные не показаны). Однако анализ динамики нервных стволовых клеток на уровне популяции затруднен изменениями количества помеченных потомков с течением времени ( 5, 42 ). Проблемы интерпретации анализа на уровне популяции усугубляются тем, что Klf9 также экспрессируется в незрелых нейронах взрослых и зрелых зубчатых гранулярных клетках.Таким образом, изменения в количестве меченых потомков после потери Klf9 в RGLs затрудняют интерпретацию отслеживания клонов на уровне популяции. Следовательно, чтобы непосредственно исследовать, приводит ли потеря Klf9 в RGL к экспансии нервных стволовых клеток на уровне одного клона, мы выполнили клональный анализ in vivo в Gli1 Cre ^ERT2 взрослых; Klf9 ^{ф / ф или + / +} ; Мыши Ai14 вскоре после введения низких доз тамоксифена. Однократная доза ТАМ в дозе 50 мг / кг массы тела позволила разреженное мечение одиночных tdTomato + RGL и визуализацию меченых одиночных клонов RGL и их отдельных составляющих.Анализ клональной композиции при 7dpi выявил значительно большую фракцию клонов, содержащих мульти-RGL, и меньшую фракцию клонов, содержащих одиночный RGL, через 7 дней после делеции Klf9 в RGL (, рисунки 2A-D ) (рисунок 2B, двусторонний дисперсионный анализ ANOVA). , Генотип X Клеточный тип p <0,0001, Bonferroni post hoc Klf9 ^{+ / +} vs. Klf9 ^{f / f.} 1RGL нс, 2 + RGL p <0,0001, 1RGL + p <0,0001, нет RGL нс Рисунок 2D, левая панель, двусторонний дисперсионный анализ, генотип X Клеточный тип p <0.0001, Bonferroni post hoc Klf9 ^{+ / +} по сравнению с Klf9 ^{f / f.} 2 + RGLs p = 0,09, 2RGLs + P + A p <0,0001, 2RGLs + P n.s. Рисунок 2D, правая панель, двусторонний дисперсионный анализ, генотип X, клеточный тип, p = 0,09, Bonferroni post hoc Klf9 ^{+ / +} по сравнению с Klf9 ^{f / f.} 1RGL n.s., 1RGL + P + A p = 0,01, 1RGLs + P p = 0,01). Многие из клонов, содержащих мульти-RGL, также состоят из нейральных предшественников и астроцитов, что позволяет предположить, что потеря Klf9 смещает экспансию RGL, но не предотвращает дифференцировку RGL в потомство ( Рисунок 2D ).Чтобы подтвердить эти результаты и устранить любую потенциальную путаницу, вызванную смещением в трассировщике генетического клона Ai14, мы выполнили клональный анализ с разрешением 7 точек на дюйм с использованием другого репортера отслеживания клонов, mTmG ( t (ROSA) 26Sor ^{tm4 (ACTB-tdTomato, — EGFP) Luo} / J) ( 45 ). Наш анализ продемонстрировал значительное увеличение количества клонов с несколькими RGL и снижение количества клонов с одним RGL, полученных из RGL, лишенных Klf9 в Gli1 Cre ^ERT2 ; Klf9 ^{f / f} mTmG мышей ( Фигуры 2E-F ) (Рисунок 2F, Двусторонний дисперсионный анализ, генотип X клеточного типа p <0.0001, Bonferroni post hoc Klf9 ^{+ / +} по сравнению с Klf9 ^{f / f.} 1RGL n.s., 2 + RGLs p = 0,0001, 1 + RGLs p = 0,03, без RGLs n.s). Отсутствие различий в одиночных клонах RGL предполагает, что потеря Klf9 поддерживает активированное состояние, связанное с увеличением симметричных делений. В качестве альтернативы, это может отражать эффект пола в анализе, который препятствует обнаружению уменьшения количества. Эти находки предоставляют доказательства для Klf9 в клеточно-автономной регуляции экспансии RGL и наводят на мысль о роли Klf9 в ингибировании симметричного самообновления RGLs.

(AD) Клональный анализ редко меченных Gli1 + RGL во взрослых Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{+ / + или f / f} : Ai14 мышей при 7dpi . (A, C) Типичные изображения меченых клонов и потомков RGL. Например, верхний: одиночный RGL (белая стрелка), нижний: 2 RGL. Идентификация была основана на морфологии tdTomato + и иммуногистохимии GFAP. (B) Статистическое представление клонов для указанных композиций для обоих генотипов, выраженное в виде количественной доли от общего числа клонов.(D) Разбивка клонов на 2RGL + (2 или более RGL, содержащих клоны и потомство) и отдельные клоны RGL + (клоны, содержащие только 1 RGL и потомство). Потеря Klf9 в Gli1 + RGL приводит к статистически значимой избыточной представленности 2 или более RGL-содержащих клонов и значительному снижению «1 RGL-содержащих клонов», что свидетельствует о Klf9 , репрессирующем экспансию RGL. n = 4 мыши / группа.

(E-F) Клональный анализ редко меченных Gli1 + RGL (белая стрелка) у взрослых мышей Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{+ / + или f / f} : mTmG при 7 dpi.Индуцибельная делеция Klf9 в Gli1 + RGL приводит к статистически значимой избыточной представленности клонов, содержащих multiRGL (2 или более RGL, 2RGL +), и к значительному снижению количества клонов, содержащих одиночные RGL (1RGL +). Идентификация была основана на морфологии GFP + и иммуногистохимии GFAP. Репрезентативные изображения (E) и соответствующая количественная оценка в (F). n = 4 и 5 мышей / группа.

P: прародитель, A: астроцит. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. * p <0,05, *** p <0,001, **** p <0.0001. Масштабная линейка на рисунках 2A, 2C и 2E 20 мкм.

Чтобы однозначно установить клональное происхождение меченого потомства и напрямую проверить гипотезу о том, что Klf9 ингибирует симметричное самообновление RGL in vivo , мы провели продольное двухфотонная визуализация ( 46 ) RGL на срок до двух месяцев и отслеживание симметричных и асимметричных схем разделения ( Рисунки 3A-B; Рисунки S3A-B, Дополнительные фильмы S1-S4 ).Мы имплантировали Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{f / f или + / +} ; Ai14 мышам с окном гиппокампа над CA1 для долгосрочной визуализации. После 2 недель восстановления после операции мы ввели мышам однократную дозу тамоксифена (150 мг / кг), чтобы вызвать рекомбинацию Cre и экспрессию tdTomato в Gli1 + RGL. Это привело к редкой маркировке, которая позволила нам отображать и отслеживать отдельные клетки и их процессы. Сеансы визуализации начинались через 2 дня после инъекции тамоксифена (dpi) и повторялись ежедневно до 6 dpi для обнаружения изолированных меченых RGL, которые были четко идентифицированы по их пучковидному радиальному отростку.Иногда астроциты метили, но их можно было легко отличить от RGL из-за отсутствия полярной морфологии и не принимали во внимание. Последующий гистологический анализ морфологических особенностей и иммунореактивности для GFAP в срезах мозга подтвердил нашу первоначальную идентификацию in vivo RGL ( Рисунок S3 ). После 6 dpi мы отслеживаем отдельные RGL для количественной оценки их первого события деления: мы повторно посещали каждое ранее идентифицированное поле зрения, содержащее RGL, каждые три дня и сравнивали его с предыдущими временными точками, чтобы количественно оценить первое деление клетки и классифицировать его как симметричное. или асимметричный.Как описано ранее ( 9 ), асимметричные деления приводили к появлению подвижных дочерних клеток, которые мигрировали от своих предков в течение 1-2 сеансов визуализации (3-6 дней) и демонстрировали более короткие и менее стабильные процессы, часто подвергаясь дальнейшим делениям и дифференцировке ( Рисунок 3B ) (Дополнительный фильм S1) . Напротив, как показано ранее ( 9 ), симметричные деления привели к появлению слабого радиального отростка единственной статической дочерней клетки, которая оставалась смежной со своей материнской клеткой ( Рисунок 3B) (Дополнительные фильмы S2-S4) .Со временем появилось клеточное тело дочери RGL. Для нашего анализа клеточного деления мы рассматривали только первое событие деления от идентифицированного RGL, игнорируя последующие деления дочерних клеток и анализ деревьев клонов, производных от RGL. Удаление Klf9 в RGL привело к значительно большему количеству симметричных клеточных делений (39 симметричных, 38 асимметричных, 10 мышей) по сравнению с Klf9 ^{+ / +} RGL (18 симметричных, 47 асимметричных, 8 мышей) ( Рисунок 3C ).Мы позаботились о том, чтобы у обоих генотипов было одинаковое количество событий деления, чтобы мы были уверены, что различия в способе деления не связаны с недостаточной / избыточной выборкой каждой экспериментальной группы (N = 8 контрольных мышей, 65 делений, среднее значение 8,125). делений на мышь; 10 экспериментальных мышей, 77 делений, в среднем 7,7 делений на мышь) ( Рисунок 3D ). Эти данные предоставляют окончательные доказательства того, что Klf9 функционирует как тормоз симметричного самообновления RGLs в гиппокампе взрослых.

(A) Схема экспериментального дизайна для in vivo 2-фотонных экспериментов по визуализации. Вставка представляет собой изображение с большим увеличением единичного RGL с разреженной меткой у взрослой мыши Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{+ / +} : Ai14.

(B) Типичная серия продольных изображений из четырех полей зрения, показывающих симметричные и асимметричные участки RGL. Стрелки указывают на материнскую ячейку, а стрелки указывают на дочерние ячейки.Масштабные линейки: 20 мкм.

(C) Количественная оценка симметричных и асимметричных делений RGL, показывающая увеличение симметричных делений у мышей Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{f / f} : Ai14. n = 8 Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{+ / +} : мыши Ai14, 65 делений; n = 10 Gli1 Cre ^ERT2 : Klf9 ^{f / f} : мыши Ai14, 77 делений. Шансы на симметричное деление в 2,7 раза выше в тесте Klf9 f / f, p = 0,015 Тест отношения правдоподобия.

(D) Аналогичное количество делений было зарегистрировано для каждой группы, чтобы избежать предвзятой оценки режима деления (n = 8 и 10 мышей / группа).

См. Также соответствующий дополнительный рисунок 3 и дополнительные фильмы S1, S2, S3 и S4.

Чтобы понять, как Klf9 регулирует режим деления RGL, мы выполнили in vivo молекулярное профилирование RGLs, лишенных Klf9 . Мы сгенерировали Gli1Cre ^ERT2 : Rpl22HA ^{f / +} : Klf9 ^{f / f или + / +} (B6N.129- Rpl22tm1 . 1Psam / J мышей (Ribotag) мышей ( 47 ) для генетического ограничения экспрессии рибосомной субъединицы, меченной эпитопом гемагглютинина (НА), исключительно в Gli1 + RGL ( Рисунок 4A ).Через четыре дня после инъекций ТАМ для индукции экспрессии НА и рекомбинации Klf9 в достаточном количестве Gli1 + RGL и потомков, возникающих в результате первого деления, мы вскрыли подобласть зубчатой ​​извилины, биохимически изолировали активно транслируемые транскрипты, сгенерировали библиотеки кДНК и провели секвенирование Illumina (Фигуры 4A-C) . Анализ полученных данных и аннотация генной онтологии (gGOSt, https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) дифференциально экспрессируемых генов (DEG) (дополнительная таблица 1) широко классифицированных сигнальных пути и связанных молекулярных программ с активацией и покоем нервных стволовых клеток ( 32, 34, 48-52 ) ( Рисунок 4C; Рисунок S4, дополнительные таблицы 2 и 3 ).Функциональные категории, обогащенные среди активированных ДЭГ (276), включали активность фосфолипазы (Pla2g7, Pla2g4e, Gpld1), передачу сигналов фактора роста митогена (Egfr, Fgfr3, Ntrk2, Lfng) и лиганд-зависимые ионные каналы (Gabra1, Chrna7, Grin2C). Кроме того, наш анализ выявил усиление метаболических программ, поддерживающих выработку энергии и липогенез за счет генерации активности ацетил-КоА: КоА и лигазы жирных кислот (Acsl3, Ascl6, Acss1, Acsbg1) и активности оксидоредуктазы и альдегиддегидрогеназы (Acad12, Acox1, Ak1b10 , Aldh4b1, Aldh5a1) ( 52-55 ) (Дополнительная таблица 2) .Дополнительным набором модулей, избыточно представленных в наборе подавленных генов (462 DEG), были передача сигналов фактора роста в состоянии покоя (Bmp2, Bmp4), связывание внеклеточного матрикса (Itga3, Itga10, Igfbp), клеточная адгезия (например: Emb, Itga3, Itga5), связывание с актином (Iqgap1), факторы транскрипции (NeuroD4, Zic3) и активность калиевых каналов, управляемых напряжением (Kcnj8, Kcnq1) (дополнительная таблица 3) .

(A) Схема экспериментального рабочего процесса по биохимическому выделению и секвенированию транслируемых мРНК из Gli1 + RGL (Gli1Cre ^ERT2 : Rpl22HA ^{f / +} : Klf9 ^{f / f или + / +} мышей).n = 3 мыши, 6 зубчатых извилин на образец, 3 образца на группу.

(B) График анализа главных компонентов (PCA) трансляционных профилей Gli1Cre ^ERT2 , нацеленных на Klf9 ^{+ / + или f / f} RGL. Первые два главных компонента показаны с соответствующими долями дисперсии.

(C) Слева: тепловая карта значений экспрессии для дифференциально экспрессируемых генов. В центре: график статистической значимости вулкана (-log10 P-value) в зависимости от величины изменения (log2 кратного изменения) экспрессии гена.Красным отмечены дифференциально экспрессируемые гены. Активированные гены в RGL Klf9 ^{f / f} находятся справа, а гены с пониженной регуляцией в RGL Klf9 ^{f / f} слева. Справа: диаграмма количества генов с повышенной и пониженной регуляцией в Gli1Cre ^ERT2 , нацеленных на Klf9 ^{f / f} RGL.

(D) qRT-PCR на биохимически выделенных мРНК от Gli1Cre ^ERT2 : Rpl22HA ^{f / +} : Klf9 ^{f / f или + / +} мышей, проверяющих кандидаты на дифференциально экспрессируемые гены.n = 3 мыши, 6 зубчатых извилин на образец, 3 образца на группу.

(E) Иммуноокрашивание и количественная оценка NICD в RGL мышей Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{f / f или + / +} . Делеция Klf9 приводит к увеличению уровней NICD в RGL, что согласуется с Lnfg-зависимой потенциацией передачи сигналов Notch2 (рисунок, вверху слева). n = 3 мыши / группа. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Масштабная линейка: верхняя, 20 мкм; низ, 10 мкм.

См. Также соответствующий дополнительный рисунок 4 и дополнительные таблицы 1-3.

Для проверки ДЭГ, ранее связанных с покоем и активацией нервных стволовых клеток ( 32, 34, 49, 50, 52, 56 ), мы выполнили qRT-PCR на независимой реплике биохимически изолированных мРНК из этой популяции Gli1 + RGLs in vivo . Мы впервые подтвердили подавление Klf9 в RGL. Затем мы подтвердили подавление канонических сигнальных факторов покоя (Bmp4) и активацию генов, участвующих в метаболизме липидов (Pla2g7), клеточном цикле (Ccn1a), передаче сигналов митогена (рецептор эпидермального фактора роста, Egfr) и передаче сигналов Notch (Lunatic fringe, Lfng. ) (Рисунок 4D) .В соответствии с Lfng-опосредованным усилением передачи сигналов Notch2 посредством расщепления внутриклеточного домена Notch2 (NICD), мы наблюдали значительно повышенные уровни NICD в Gli1 + RGL, лишенных Klf9 ( Рисунок 4E ) ( 51, 57 ). Из наших данных о потере функции мы делаем вывод, что высокие уровни Klf9 в RGL индуцируют экспрессию BMP4 и репрессируют генные модули, определяющие передачу сигналов митогена, окисление жирных кислот, дифференцировку RGL и выход из клеточного цикла для ингибирования экспансии RGL.

Discussion

Центральным элементом зависимой от опыта регуляции нейрогенеза является способность RGLs постоянно уравновешивать потребности нейрогенеза и астрогенеза или экспансии RGL с самосохранением посредством регуляции покоя.Поскольку интерпретация внешнего мира зависит от интеграции и конвергенции физиологических внеклеточных сигналов на TF в RGL, обогащение и неблагоприятный опыт, вероятно, будут модулировать баланс между программами транскрипции, которые регулируют режимы деления RGL, поддерживающие усиление или асимметричное самообновление ( 22 ). Однако, в отличие от наших знаний о TFs, которые регулируют асимметричное самообновление RGLs в гиппокампе взрослых ( 32-36 ), идентичность транскрипционных регуляторов симметричного самообновления RGLs остается неуловимой.Комбинируя условную генетику мышей с in vivo клональным анализом и продольной двухфотонной визуализацией RGL, мы продемонстрировали, что Klf9 действует как транскрипционный тормоз на состояние активации и экспансию RGL за счет ингибирования симметричного самообновления ( Рисунок 5 ).

RGL интегрируют внеклеточные, эмпирические сигналы для выхода из состояния покоя, доминантного состояния и активации. Klf9, экспрессия повышена в покоящихся RGL. Низкие уровни Klf9 в RGL связаны с повышенной активацией. После активации RGL, в которых отсутствует Klf9 , смещаются в сторону симметричного самообновления и расширения RGL. Трансляционное профилирование RGL показывает, как потеря Klf9 приводит к подавлению программы покоя и активации генетических (митоген, notch) и метаболических (окисление жирных кислот и передача сигналов липидов) программ, лежащих в основе симметричного самообновления RGL.Здесь показаны кандидаты, дифференциально экспрессирующиеся с повышенной (оранжевый) и подавляющей (синий) генами в RGL после делеции Klf9 . Гены, выделенные жирным шрифтом, означают подтверждение с помощью qRT-PCR.

То, что экспрессия Klf9 выше в неделящихся RGL, чем в активированных RGL, согласуется с профилированием экспрессии генов покоящихся взрослых RGL гиппокампа ( 42, 52 ) (Jaeger and Jessberger, личное сообщение) и других покоящихся соматических стволовых клеток, таких как сателлитные клетки ( 58 ) и нервные стволовые клетки в субвентрикулярной зоне ( 49, 59, 60 ).Потеря Klf9 в Gli1 + RGL приводит к усилению активации RGL. Основываясь на нашем клональном анализе продукции RGL и профилировании трансляции in vivo, мы думаем, что эта повышенная активация RGL отражает поддержание активированного или циклического состояния (также обсуждается позже) для поддержки повышенного симметричного самообновления ( 6 ).

Наши текущие знания о TFs, которые регулируют симметричное самообновление в гиппокампе взрослых, могут быть экстраполированы только из исследований развития гиппокампа ( 61 ).Клональный анализ Gli1-нацеленных RGL выявил множественные RGL-содержащие клоны с потомством. Это потенциально отражает конкуренцию между TF, которая диктует баланс между симметричными и асимметричными делениями, компенсацию нижестоящими эффекторами Klf9 или ограничения на расширение RGL, налагаемые доступностью факторов ниши. Такие компенсаторные механизмы могут также объяснить, почему конститутивная делеция Klf9 не влияет явно на размер зубчатой ​​извилины ( 39 ).

Исследования нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников гиппокампа взрослых основывались на анализах, которые индуцируют покой и активацию in vitro ( 52 ), объективное профилирование отдельных клеток нейрогенеза ( 50, 51 ) или FACS-сортировку нервных стволовых клеток и нервных клеток. клетки-предшественники in vivo ( 34 ).Поскольку асимметричное самообновление является преобладающим способом деления, наиболее вероятно, что профиль активации RGL, выведенный из этих исследований, смещен в сторону асимметричного, а не симметричного самообновления. Напротив, наше трансляционное профилирование in vivo долгосрочной самообновляющейся популяции Gli1 + RGL после клеточно-автономной делеции Klf9 позволило нам сделать вывод, как изменения в экспрессии генов связаны с симметричным режимом деления RGL, и создать исследовательский ресурс для Сообщество нервных стволовых клеток.Хотя профилирование рибосом не позволяет выделить транскрипты из одиночных RGL, оно предлагает другие преимущества, такие как минимизация стрессовой реакции, связанной с диссоциацией клеток ( 62 ). Поскольку Gli1CreERT2 специально нацелен на RGL и астроциты (но не на предшественников), и мы выполнили биохимическое профилирование через 4 дня после рекомбинации, когда мы впервые наблюдаем потомство, полученное из RGL, наш анализ в значительной степени отражает изменения в популяции RGL, потомстве, возникающем от первого деления и астроцитов.То, что мы наблюдаем обогащение генов, экспрессируемых исключительно в RGL, позволяет нам связать экспрессию генов с изменениями в количестве RGL, обусловленными режимом деления. Анализ уровней Klf9 с помощью qRT-PCR предполагает более чем 50% эффективность рекомбинации Klf9 в целевых популяциях клеток. Наш анализ экспрессии по всему геному предполагает, что Klf9 функционирует как активатор или репрессор в зависимости от клеточного контекста, хотя репрессия, по-видимому, является доминирующим способом регуляции генов ( 63, 64 ).Проверка конкретных DEG в биохимически изолированных транскриптах из RGL предполагает, что Klf9 может активировать экспрессию BMP4 в RGL для подавления активации in vivo ( 48 ). Кроме того, Klf9 подавляет пролиферацию RGL посредством репрессии тирозинкиназ рецептора передачи сигналов митогена (EGFR), липидогенеза (Pla2g7) и клеточного цикла (CyclinA1). Интересно, что Pla2g7 экспрессируется только в RGL и астроцитах в DG ( 50, 51 ) и как таковой может представлять новый маркер активированных RGL.Учитывая двойную роль передачи сигналов Notch в регуляции активных и покоящихся RGLs ( 65 ), мы подтвердили, что Lfng значительно активируется в RGL, лишенных Klf9. Lfng экспрессируется исключительно в RGL, способствует передаче сигналов Notch2 посредством гликозилирования Notch2 и генерации NICD после связывания лиганда и диктует активацию RGL лиганд-зависимым образом ( 66 ). Генетическая сверхэкспрессия Lfng в предшественниках Т-клеток поддерживала Notch2-опосредованное самообновление и клональную экспансию за счет дифференцировки ( 67 ).В соответствии с активацией Lfng в RGLs, мы наблюдали повышенные уровни NICD в Gli1 + RGL, лишенных Klf9, что указывает на усиление передачи сигналов Notch2.

Биоинформатический анализ наших данных выявил усиленное β-окисление жирных кислот (FAO), субстрат для производства энергии и липогенеза в качестве метаболической программы, задействованной для поддержания экспансии RGL ( Рисунок 5 ). Фактически, исследования по отслеживанию клонов на эмбриональных неокортикальных нервных стволовых клетках продемонстрировали роль ФАО в поддержании идентичности и пролиферации нервных стволовых клеток ( 53 ).В частности, ингибирование Tmlhe (фермента биосинтеза карнитина) и β-окисления карнитин-зависимых длинноцепочечных жирных кислот (карнитинпальмитоилтрансфераза I, CPT1, которая катализирует лимитирующую скорость реакции в этом процессе) привело к заметному увеличению симметричных дифференцирующихся делений. за счет как симметричного, так и асимметричного самообновления нервных стволовых клеток ( 55 ). Ингибирование ФАО предотвращает поддержание гемопоэтических стволовых клеток и способствует симметричным дифференцирующимся делениям гемопоэтических стволовых клеток ( 68 ).Делеция Cpt1a (и ингибирование FAO) в нейральных стволовых клетках и предшественниках гиппокампа взрослых нарушала экспансию и уменьшала количество RGL, хотя не удалось определить, было ли это связано со смертью и / или ингибированием симметричного самообновления RGL ( 54 ).

Как Klf9 действует как тормоз для симметричного самообновления RGL? Мы предполагаем, что Klf9 ко-репрессирует набор генов, связанных с поддержанием RGLs в режиме симметричного деления. Новаторские исследования показали участие передачи сигналов Notch в поддержании симметричных делений нейроэпителиальных клеток ( 69 ), экспансии предполагаемых нервных стволовых клеток и предшественников ( 70 ) и поддержании идентичности радиальных глиальных клеток посредством ингибирования дифференцировки и выхода из клеточного цикла ( 71, 72 ).Важно, что генетическое усиление функции передачи сигналов Notch2 в RGLs у взрослых DG поддерживает RGL за счет нейрогенеза гиппокампа ( 73 ). Klf9 может также напрямую подавлять прогенерическую программу в RGL (например, NeuroD4, подавленный DEG, Supplementary Table 3 ) ( 74 ) или косвенно через конкурентные взаимодействия с TF, которые регулируют асимметричное самообновление RGL. Взятые вместе, потеря Klf9 в RGLs стимулирует экспансию за счет усиленной передачи сигналов митогена и клеточного цикла ( 75 ), предотвращения дифференцировки RGL и усиления липогенных и метаболических программ FAO ( Рисунок 5 ).

Наши результаты стимулируют дискуссию о том, как эмпирические сигналы регулируют активацию и расширение RGL. На сегодняшний день показано, что передача сигналов GABA (A) R и PTEN (путем ингибирования пути PI3K-Akt) способствует покою и подавляет деления амплификации RGL ( 5, 25 ). Вероятно, что Klf9 участвует в этих сигнальных путях в качестве нижестоящего исполнительного механизма. Экспрессия Klf9 снижена в нервных стволовых клетках, лишенных FoxO3 ( 60 ). Таким образом, Akt-зависимая регуляция активации нервных стволовых клеток посредством инактивации FoxO3 ( 31 ) может потребовать подавления Klf9 .Поскольку некоторые из идентифицированных генов-мишеней Klf9 также регулируются другими ТФ [(например, ингибирование EGFR и cyclinA1 с помощью Notch3 ( 34 ), активация Pla2g7 с помощью FoxO3 ( 60 )], мы заключаем, что эти факторы не компенсируют друг друга, но вместо этого обеспечивают гибкую интеграцию разнообразных физиологических сигналов в RGL для регулирования активации. Также было показано, что ингибирование пульсирующей передачи сигналов глюкокортикоидных рецепторов способствует покою RGL ( 24 ). Поскольку экспрессия Klf9 регулируется передачей сигналов стероидного гормона и нейральная активность ( 39, 76, 77 ) и Klf9 репрессируют экспрессию генов за счет рекрутирования корепрессорного комплекса mSin3A ( 78 ), Klf9 может поддерживать эпигенетический механизм обратимого, эмпирического регулирования принятия решений NSC.

Наш набор данных по всему геному служит общим исследовательским ресурсом сообщества несколькими способами. Во-первых, он катализирует дальнейшие исследования механизмов, лежащих в основе покоя и размножения нервных стволовых клеток. В качестве примера гены-кандидаты, такие как молекула клеточной адгезии Эмбигин (подавленная DEG), регулируют покой гемопоэтических стволовых / клеток-предшественников ( 79 ), тогда как было показано, что никотиновый рецептор альфа7 (повышенная регуляция DEG), ChrnA7, необходим для ведение номеров RGL ( 80 ).Во-вторых, многочисленные гены, идентифицированные в нашей программе, участвуют в управлении онкогенезом и, как таковые, могут определять стратегии дифференцировки, чтобы блокировать пролиферацию опухолей ( 81 ). В-третьих, наша работа мотивирует оценку того, как Klf9 может связывать внеклеточные физиологические сигналы с генетическими и метаболическими программами в RGL. В-четвертых, наши находки могут направлять исследование функционального значения обогащения Klf9 в др. Покоящихся нейронных (SVZ) ( 49, 59, 60 ) и соматических популяциях стволовых клеток ( 58 ).

Наше исследование позволяет более целостную оценку того, как конкурирующие транскрипционные программы в RGLs опосредуют принятие решений, включая регуляторы симметричного и асимметричного самообновления. Более глубокое понимание Klf9-зависимой регуляции гомеостаза RGL может направлять генетические и метаболические стратегии для пополнения резервуара RGL и восстановления нейрогенеза после травмы или увеличения пула NSC в ожидании будущих нейрогенных требований для поддержки обработки гиппокампа зависимой памяти и эмоциональной регуляции ( 19 , 20, 38 ).

Материалы и методы

С животными обращались, и эксперименты проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных в больнице Массачусетса и Медицинским колледжем Альберта Эйнштейна в соответствии с руководящими принципами NIH. Мышей содержали по три-четыре на клетку в 12-часовой (с 7:00 до 19:00) светлой / темной комнате колонии при температуре 22–24 ° C с неограниченным доступом к пище и воде.

Линии мышей

Следующие линии мышей были получены из Jackson Labs: Klf9 — lacZ knock-in (инвентарный номер: 012909), Gli1Cre ^ERT2 (инвентарный номер: 007913), Ai14 (инвентарный номер: 007908) ), мТл / мГ (инвентарный номер: 007676), B6N.129- Rpl22 ^{TM1 . 1Psam} / J (RiboTag) (инвентарный номер: 011029), POMC-Cre (инвентарный номер 010714). Трансгенные мыши Sox1tTA ( 44 ) были получены от доктора Роберта Блеллоха (Калифорнийский университет, Сан-Франциско). Klf9 ^{LacZ / LacZ} мышей были получены от доктора Йошиаки Фудзи-Курияма (Университет Цукуба, также доступны от Jackson Labs, инвентарный номер: 012909). Мышей с нокаутом tetO Kf9 / Klf9 были созданы нами ранее ( 38 ).Мыши Nestin GFP ( 40 ) были получены от доктора Дэвида Скэддена из MGH.

Klf9 мышей с условным нокаутом получали путем нацеливания на гомологичный ген с использованием клеток C57BL / 6 ES от Cyagen. F0 скрещивали с мышами C57BL / 6J для получения F1 с передачей по зародышевой линии, и мышей подвергали обратному скрещиванию с мышами C57BL / 6J в течение 5+ поколений. Набор праймеров (вперед: GGTAGTCAAATGGCGCAGCTTTT; обратный: CCATCCATTCCTTCATCAGTCTCC) использовали для генотипа мышей Klf9 ^{+ / + или f / f} для амплификации мутантной полосы длиной 363 п.н. и полосы дикого типа 240 п.н.Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{+ / + или f / f} Ai14, Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{+ / + или f / f} : mT / mG +/-, были созданы с помощью скрещивание мышей Gli1Cre ^ERT2 с мышами mT / mG или Ai14 и Klf9 ^{+ / + или f / f} .

Введение BrdU

Для анализа пролиферации клеток в зубчатой ​​извилине мышам вводили BrdU (200 мг / кг веса тела, внутрибрюшинно) и брали пробы через 2 часа.Для анализа клеток, длительно сохраняющихся в зубчатой ​​извилине, мышам вводили ежедневную инъекцию BrdU (25 мг / кг массы тела, внутрибрюшинно) в течение 14 дней и отбирали пробы через 24 часа после последней инъекции.

Введение тамоксифена

Тамоксифен (20 мг / мл, Sigma, T5648) был свежеприготовленным в 10% этаноле кукурузного масла (Sigma C8267). Для анализа популяции 8-недельным самцам и самкам мышей внутрибрюшинно вводили дозу 150 мг / кг или 250 мг / кг (, фиг. 1F, ). Для клонального анализа использовались дозы 50 мг / кг и 100 мг / кг в репортерных линиях Ai14 и mT / mG соответственно ( Рисунок 2A и Рисунок 2E ).Образцы мышей отбирали через 7 или 28 дней после инъекции тамоксифена. Для двухфотонной визуализации (, рис. 3A, ) одна доза тамоксифена в 150 мг / кг вводилась за 2 дня до визуализации in vivo . Для профилирования рибосом доза 375 мг / кг массы тела вводилась внутрибрюшинно мышам в течение 2-3 месяцев каждые 12 часов 3 раза. Образцы мышей отбирали через 4 дня после последней инъекции (, фиг. 4A, ).

Обработка тканей и иммуноокрашивание

Криосрезы 35 мкм, полученные из перфузированной ткани, хранили в PBS с 0.01% азид натрия при 4 ° C. Для иммуноокрашивания плавающие срезы промывали PBS, блокировали PBS, содержащим 0,3% Triton X-100 и 10% нормальной ослиной сыворотки, и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C в течение ночи (Rockland, кроличьи анти-RFP, 1: 500; Millipore, куриный анти-GFAP, 1: 2000; козий анти-GFP, Novus, 1: 500; Santa Cruz, sc-8066, козий анти-DCX, 1: 500). Mcm2 (BD Biosciences, мышиные анти-Mcm2; 1: 500), GFP (Abcam, куриные анти-GFP, 1: 2000), LacZ (Promega, мышиные анти-бета-галактозидазы, 1: 2000) и Nestin (Aves lab, куриные анти-нестиновые, 1: 400) антигены получали путем инкубации срезов мозга в лимонном буфере в скороварке (Aprum, 2100 Retriever) в течение 20 минут с последующим охлаждением в течение 60 минут до комнатной температуры.Антиген BrdU был получен путем инкубации срезов мозга в 2 н. HCl в течение 30 минут при 37 ° C после 15-минутной фиксации в 4% PFA на ранее обработанном флуоресцентном сигнале. На следующий день срезы промывали три раза по 10 мин в PBS и инкубировали в течение 90 мин с вторичным антителом, связанным с флуоресцентной меткой (Jackson ImmunoResearch, 1: 500). Срезы промывали три раза по 10 мин каждый в PBS перед нанесением на предметные стекла (если применимо) и закрывали средой для закрепления, содержащей DAPI (Fluoromount с DAPI, Southern Biotech).Иммуноокрашивание NICD (кроличьи антитела против расщепленного Notch2, Assay Biotech Cat # L0119 RRID: AB_10687460 при 1: 100) проводили, как описано ( 66 ).

Мы использовали линию трансгенных мышей, которая экспрессирует GFP под контролем промотора Nestin для мечения тел клеток ( 40 ). Мышей умерщвляли через 2 часа после однократной инъекции BrdU (200 мг / кг). Экспрессия Klf9 была обнаружена с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием антисмыслового зонда Klf9 , комплементарного экзону 1 (530-1035 п.о.) мРНК Klf9 .Вкратце, гибридизацию in situ (ISH) выполняли с использованием рибозондов, меченных диоксигенином, на 35 мкм криосрезах, полученных из перфузированной ткани, как описано ( 38 ). Предварительно смешанные смеси нуклеотидов для мечения РНК, содержащие меченый дигоксигенином UTP (Roche Molecular Biochemicals), использовали для создания РНК-рибозондов. Klf9 нулевых мышей использовали в качестве отрицательного контроля и для подтверждения специфичности рибозонда. Рибозонды очищали на колонках G-50 Microspin (GE Healthcare). Концентрация зонда была подтверждена Nanodrop перед добавлением формамида.Срезы помещали на предметные стекла с заряженным стеклом (Superfrost Plus) и фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA). Затем срезы промывали PBS, обработанным DEPC, обрабатывали протеиназой K (конечная концентрация 40 мкг / мл), снова промывали PBS, обработанным DEPC, и затем ацетилировали. После предгибридизации срезы инкубировали с рибозондом в течение ночи при 60 ° C, промывали в уменьшающихся концентрациях буфера SSC ​​и иммунологическое детектирование проводили с использованием антител к пероксидазе против DIG (Roche) при 4 ° C в течение ночи и визуализировали с использованием Cy3-конъюгированного тирамида. Система усиления сигнала (Perkin-Elmer) при комнатной температуре. In situ за гибридизацией следовало иммуноокрашивание на GFP (Goat anti-GFP, Novus, 1: 500) и BrdU (Rat anti-BrdU, Biorad, 1: 500), инкубировали при 4 ° C в течение ночи с последующей инкубацией 488 — и вторичные антитела, конъюгированные с Cy5 (Jackson ImmunoResearch, 1: 500), в течение 2 часов при комнатной температуре. Klf9 in situ. Гибридизацию проводили на мышах POMC-Cre: Klf9 ^{+ / + и f / f} с использованием зонда Klf9 exon1 для проверки условного нокаута Klf9 мышей.Иммунологическое обнаружение проводили с помощью антитела против DIG, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Roche). Цветную реакцию проводили с NBT / BCIP. Klf9 нулевых мышей использовали в качестве отрицательного контроля.

Получение и анализ изображений

Изображения были получены из одного набора срезов мозга (6 наборов, созданных для каждого мозга) для каждого эксперимента по иммуноокрашиванию (набор антигенов). Окрашенные срезы визуализировали при 20-кратном или 40-кратном увеличении на конфокальном лазере Nikon A1R Si, инвертированном исследовательском микроскопе TiE или конфокальном микроскопе Leica SP8.Все анализы проводились экспериментатором, слепым к групповой принадлежности.

Количественная оценка интенсивности LacZ . Мы использовали мышей, несущих аллель LacZ, нокаутированный в эндогенный аллель Klf9 ( Klf9 ^{Lac / LacZ или + / LacZ} ) ( 39 ). Klf9 ^{Lac / LacZ или + / LacZ} мышей скрещивали с мышами Nestin GFP для картирования уровней экспрессии LacZ в покоящихся RGL (GFP + MCM2- с радиальным отростком), активированных RGL (GFP + MCM2 + с радиальный отросток) и NPC (GFP + MCM2 + без радиальных отростков).Различие между RGL и NPC определяли с помощью морфологического анализа. Изображения (разрешение 1024) были получены в виде 7 Z-стопок с размером шага 1 мкм. Для дальнейшей количественной оценки были отобраны 2-4 стопки изображений от каждой мыши. Поскольку ген LacZ был сбит в эндогенный локус Klf 9, средняя интенсивность экспрессии Lac Z, оцененная по флуоресцентному сигналу с иммуноокрашиванием LacZ с использованием программного обеспечения ImageJ в каждом теле клетки GFP +, была использована в качестве суррогата для Экспрессия Klf9 у мышей Klf9 ^{+ / LacZ} .Средняя интенсивность фона была получена из LacZ отрицательных областей, разделенных из расчетов в том же разделе. Klf9 Количественная оценка сигнала FISH. Изображения (разрешение 2048) были получены конфокальным микроскопом Leica SP8 в виде 30 Z-стопок с размером шага 0,5 мкм. Репрезентативные изображения были созданы путем экспорта составных конфокальных изображений с полным разрешением для трехмерной визуализации с использованием Imaris. Различие между нейральными клетками-предшественниками (NPC) и нервными стволовыми клетками (NSC) определяли посредством морфологического анализа с окрашиванием GFP.Активированные RGL дифференцировали от покоящихся RGL посредством окрашивания антителом BrdU (маркеры пролиферации клеток). Анализ и количественное определение интенсивности сигнала Klf9 в каждом теле клетки GFP + проводили с использованием автоматического подсчета с помощью программного обеспечения ImageJ. Изображения были преобразованы в 1-битные изображения. Затем было подсчитано Klf9 точек в границах тела клеток GFP + посредством анализа частиц, позволяющего регистрировать количество и средний размер точек. Интенсивность Klf9 рассчитывалась как число точек, умноженное на средний размер точек.Фон был вычтен из расчетов. Нулевых мышей Klf9, скрещенных с мышами Nestin GFP, использовали в качестве отрицательного контроля.

Анализ клональных клонов

Клональный анализ был проведен с разреженной маркировкой после оптимизации дозы тамоксифена, как описано ранее ( 5 ). Репортерных мышей Ai14 и mTmG использовали для визуализации рекомбинированных клеток. Были созданы последовательные корональные срезы и иммуноокрашены на антигены GFAP, RFP или GFP. Получение и анализ изображений были ограничены всей зубчатой ​​извилиной ∼2000 мкм вдоль дорсально-вентральной оси.RGL были классифицированы как клетки, которые были расположены в субгранулярной зоне, имели радиальные выступы, простирающиеся в слой гранулярных клеток, и были совместно помечены GFAP и RFP или GFP. Клетки с меткой GFAP без радиальных отростков, но имеющие кустистую морфологию, были идентифицированы как астроциты. Рекомбинированные клетки GFP + или RFP + без мечения GFAP в непосредственной пространственной близости к другим клеткам были идентифицированы как клетки-потомки нейронов. Отдельная клетка (астроцит или нейрон) не считалась клоном.Изображения (разрешение 1024) были получены с использованием конфокального микроскопа Leica SP8 в виде 20-25 Z-стопок с размером шага 1,5 мкм. Мышей с менее чем 2 клонами на полусекцию в среднем определяли как стандарт для разреженного мечения и отбирали для клонального анализа. За исключением категории одного клона RGL, все меченые клетки в одном клоне находились в непосредственной пространственной близости друг к другу. Клоны классифицировали в соответствии с наличием или отсутствием RGL и типом потомства.

Двухфотонная визуализация Gli1 +

Gli1Cre ^ERT2 : Klf9 ^{+ / + или f / f} : мышей Ai14 использовали для прижизненной 2P визуализации RGL.

Имплантация окна: Мы следовали установленному протоколу для имплантации черепного окна над правым полушарием дорсального гиппокампа ( 9 ). Вкратце, мы просверлили краниотомию шириной ~ 3 мм, удалили подлежащую твердую мозговую оболочку и аспирировали кору и мозолистое тело. Затем над гиппокампом помещали титановый имплантат диаметром 3 мм и глубиной 1,3 мм со стеклом, запаянным ко дну. Имплант и титановый стержень (29 × 3,8 × 1,3 мм) удерживались на месте с помощью стоматологического цемента.Для прикрепления животного к столику микроскопа использовали титановый стержень. Мышам давали однократную дозу дексаметазона (1 мг / кг, внутрибрюшинно) перед операцией для уменьшения отека мозга и карпрофена (5 мг / кг, внутрибрюшинно) для снятия воспаления и обезболивания после завершения операции. Имплантированным животным дали две недели, чтобы восстановиться после операции и дать возможность утихнуть любому воспалению.

Двухфотонная визуализация отделов aRGL: In vivo визуализация была сделана на специальном двухфотонном лазерном сканирующем микроскопе (на основе Thorlabs Bergamo) с использованием фемтосекундного импульсного лазера (Coherent Fidelity 2, 1075 нм) и 16x воды. иммерсионный объектив (0.8 NA, Nikon). Мы визуализировали мышей под анестезией изофлураном (~ 1% изофлурана в O2, об. / Об.) И прикрепили голову к столику микроскопа с помощью имплантата из титанового стержня, отдыхая на электрической грелке при 37 ° C (RWD ThermoStar). Экспрессия флуоресцентной метки tdTomato в Gli1 + RGL была индуцирована однократной инъекцией тамоксифена (150 мкл / мг) через две недели после имплантации окна. Визуализацию начинали через два дня после инъекции тамоксифена (2 точки на дюйм) и продолжали каждый день до 6 точек на дюйм, чтобы обнаружить редкие меченые RGL.Впоследствии изображения мышей делали каждые 3 дня, когда это было возможно, и снимали изображения до 60 дней. Используя систему координат, мы отметили местоположения RGL для повторной визуализации одной и той же клетки. В каждый момент времени мы получали стек трехмерных изображений каждого поля зрения, содержащий клетки, экспрессирующие tdTomato, и аннотировали их местоположение, чтобы та же самая клетка могла быть снова отображена в следующем сеансе.

Классификация деления клеток: деления клеток анализировали два разных экспериментатора, не знающих генотипа.Сначала мы скомпилировали все z-стеки в единое проецируемое суммой изображение для каждой временной точки, а затем использовали FIJI-ImageJ для анализа изображений. В анализ было включено только первое зарегистрированное деление клеток для данного клона. Мы определили симметричное деление RGL как новое RGL, генерируемое из материнского RGL, характеризующееся развитием стабильного радиального отростка и статическим поведением тел клеток в течение как минимум 6 дней после рождения. Мы определили асимметричное деление как новые нейральные клетки-предшественники, генерируемые из материнского RGL, которые демонстрируют более короткие и менее стабильные процессы.Эти NPC часто начинали мигрировать в течение 1-2 сеансов визуализации (3-6 дней).

Выделение Ribotag мРНК из Gli1 + RGL

Мы использовали Gli1Cre ^ERT2 : Rpl22HA ^{f / +} : Klf9 ^{f / f или + / +} мышей, которые обеспечивают экспрессию гемагглютинина (HA) -метки. белок RPL22 (RPL22 – HA) после рекомбинации Cre в Gli1 + Klf9 ^{f / f или + / +} RGL. Иммунопреципитация RiboTag и выделение РНК проводили через 4 дня после последней инъекции ТАМ в соответствии с исходным протоколом с небольшими изменениями ( 47 ).6 зубчатых извилин от 3 мышей объединяли на образец и гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса в 900 мкл буфера для гомогенизации с добавлением циклогексимида. Гомогенаты центрифугировали и супернатант инкубировали на ротаторе при 4 ° C в течение 4 часов с 9 мкл антитела против НА (CST Rb anti-HA # 3724, 1: 100) для связывания рибосом, меченных НА. Магнитные шарики IgG (Thermo Scientific Pierce # 88847) конъюгировали с комплексом антитело-рибосома посредством инкубации в течение ночи на ротаторе при 4 ° C. РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plus Micro (Qiagen 74034) в соответствии с протоколом производителя.Элюированную РНК хранили при -80 ° C. Для анализа обогащения 45 мкл гомогената (иммунопреципитация пре-анти-НА) откладывали после центрифугирования, хранили при -20 ° C в течение ночи и очищали с помощью набора RNeasy Micro как «входной» образец и использовали для определения обогащения NSC. Количество и качество РНК измеряли с помощью Tape Station (Agilent) и флуориметра Qubit (Thermo Fisher Scientific). Библиотеки секвенирования получали с использованием набора для сверхнизкой входной РНК (Clontech).

RNA-seq анализ

библиотеки NGS были сконструированы из общей РНК с использованием набора Clontech SMARTer v4 (Takara) с последующим секвенированием на приборе Illumina HiSeq 2500, что дало 20-30 миллионов считываний по 50 п.н. на образец.Выравниватель STAR ( 82 ) использовали для сопоставления считываний секвенирования с транскриптомом в эталонном геноме mm9 мыши. Подсчет считываний для отдельных генов производился с использованием функции незакрепленного подсчета в HTSeq v.0.6.0 ( 83 ) с последующей оценкой значений экспрессии и обнаружением дифференциально экспрессируемых транскриптов с использованием EdgeR ( 84 ), включая только гены. со счетчиком на миллион считываний (CPM)> 1 для одного или нескольких образцов ( 85 ). Дифференциально экспрессируемые гены определялись как минимум 1.2-кратное изменение при p <0,05. Данные переданы в базу данных NCBI GEO для публичного доступа и обрабатываются (инвентарный номер XXX) .

qRT-PCR

мРНК объединяли биохимически и выделяли, как описано выше для рибосомного профилирования. Комплементарную ДНК с первой цепью получали путем обратной транскрипции с помощью системы синтеза первой цепи SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific). Для количественной оценки уровней мРНК аликвоты кДНК амплифицировали со специфическими праймерами и PowerUp SYBR Master Mix (BioRad) с помощью системы обнаружения ПЦР в реальном времени CFX384 Touch (BioRad).Праймеры были оптимизированы и предназначены для гибридизации с разными экзонами. Здесь перечислены праймеры (указаны название и последовательность 5 ’-> 3’).

pla2g7 F: TCAAACTGCAGGCGCTTTTC, pla2g7 Р: AGTACAAACGCACGAAGACG

Egfr F: GCCATCTGGGCCAAAGATACC, Egfr: GTCTTCGCATGAATAGGCCAAT

Lfng F: AAGATGGCTGTGGAGTATGACC, Lfng Р: TCACTTTGTGCTCGCTGATC

Ccn1a F: GATACCTGCTCGGGGAAAGAG, Ccn1a Р: GCATTGGGGAAACTGTGTTGA

Klf9 F: AAACACGCCTCCGAAAAGAG, Klf9 R: AACTGCTTTTCCCCAGTGTG

Bmp4 F: GACCAGGTTCATTGCAGCTTTC, Bmp4 R: AAACGACCATCAGCATTCGG

Actb F: CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG000, Actb Graagg19 Анализ статистического программного обеспечения.Как сбор данных, так и количественная оценка проводились вслепую. Данные на графических панелях отражают несколько независимых экспериментов, проведенных в разные дни. Оценка вариации внутри каждой группы данных указывается с использованием стандартной ошибки среднего (SEM). Сравнение двух групп проводилось с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента, если не указано иное. Сравнение одной группы во времени проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с повторным измерением. Сравнение двух групп по условиям лечения или времени проводилось с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями, а основные эффекты или взаимодействия отслеживались апостериорным анализом Бонферрони.В подписях к тексту и рисункам «n» обозначает количество мышей в группе. Подробный статистический анализ можно найти в дополнительной таблице 4. Для получения подробной информации о статистическом анализе DEG, см. Раздел «Анализ последовательности РНК».

Двухфотонная визуализация: чтобы сравнить различия в способах деления RGL между двумя генотипами, мы использовали программное обеспечение статистического анализа R, чтобы подогнать модель обобщенных линейных смешанных эффектов (LME) к числам делений у разных мышей, используя генотип в качестве фиксированного эффекта и включение идентичности животных в качестве случайного эффекта для учета различий между отдельными животными [DivisionType∼Genotype + (1 | MouseIdentity)].p-значения были рассчитаны с помощью теста отношения правдоподобия (LRT), сравнивающего нашу модель с нулевой моделью без информации о генотипе и идентичных случайных эффектов [DivisionType∼1 + (1 | MouseIdentity)].

Вклад авторов

Концептуализация: AS и NG

Методология: NG, KM, YS, HZ, DG, CH, JC, AZ, WRM, LPW, RS, TG, AS

Исследование: NG, KM, YS, HZ, DG, CH, JC, AZ, WRM, LPW, RS, TG, AS

Визуализация: NG, KM, YS, HZ, DG, CH, JC, AZ, WRM, LPW, RS, TG, AS

Надзор: AS, TG, RS

Написание — первоначальный черновик: AS

Написание — просмотр и редактирование: AS, NG, TG, KM, YS, LPW, RS

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов

Доступность данных и материалов

Линии мыши, созданные в этом исследовании, доступны у ведущего контактного лица с заполненным соглашением о передаче материалов.Данные о секвенировании РНК были представлены в базу данных NCBI GEO для публичного доступа и обрабатываются (инвентарный номер XXX).

Другие дополнительные материалы к этой рукописи включают следующие

Таблицы S1 — S4

Дополнительная таблица 1 Полные списки дифференциально экспрессируемых генов (DEG) в Gli1 + RGL после делеции Klf9 . ДЭГ определялись как минимум 1,2-кратным изменением с FDR <0,05.

Дополнительная таблица 2 Аннотация генной онтологии (gGOSt, https: // biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) дифференциально активированных генов в Gli1 + RGL после делеции Klf9 .

Дополнительная таблица 3 Аннотации онтологии генов (gGOSt, https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) дифференциально подавляемых генов в Gli1 + RGL после делеции Klf9 .

Дополнительная таблица 4 Полный статистический анализ

Видео с S1 по S4

Дополнительный фильм S1 : Пример продольной визуализации асимметричных отделов НСК.Двухфотонная визуализация через несколько дней, показывающая два примера асимметричного деления НСК (красные стрелки).

Дополнительный фильм S2 : Пример продольной визуализации симметричных делений клеток. Двухфотонная визуализация через несколько дней, показывающая два примера симметричного деления НСК (синие стрелки).

Дополнительный фильм S3 : 3-мерная реконструкция клеток RGL, визуализированных in vivo, перед симметричным делением. Поле зрения соответствует второй строке рисунка 3B при 18 dpi.

Дополнительный фильм S4 : 3-мерная реконструкция клеток RGL, визуализированных in vivo после симметричного деления. Поле зрения соответствует второй строке рисунка 3B с разрешением 30 точек на дюйм.

Относится к рисунку 1 .

(A) Схема аллелей Klf9 дикого типа и модифицированных аллелей Klf9 .

(B) ПЦР на хвостовой ДНК, показывающая ожидаемые полосы, передающие аллели дикого типа и условные аллели.

(C) (Слева) Klf9 in situ гибридизация на срезах гиппокампа от 4-месячных мышей POMC Cre: Klf9 ^{+ / + или f / f} , демонстрирующих ожидаемый характер рекомбинации соли и перца в зубчатой ​​извилине, которая является характерный для POMC паттерн рекомбинации Cre в зубчатой ​​извилине. (Справа) Klf9 in situ гибридизация на срезах гиппокампа взрослых мышей Klf9 ^{— / —} , передающих специфичность рибозонда Klf9 .

Относится к рисунку 1 .

(A-B) Использовали две когорты взрослых мышей Sox1tTA: tetO Klf9 . Klf9 индукция в нервном стволе и предшественниках через 3 недели после приема Dox значительно снизила фракцию активированных RGL (% MCM2 + нестин + RGLS, n = 6 и 4 мыши / группа). (C-D) Второй когорте мышей давали импульсы BrdU во время окна Off Dox, когда происходит активация Klf9 .Анализ BrdU + нестин + RGL (n = 3 мыши / группа) выявил значительное снижение общего количества делящихся RGL. Репрезентативные изображения показаны здесь. Непарные t-тесты, рисунок S2B p = 0,0003, рисунок S2D p = 0,005. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. ** p <0,01, *** p <0,001

, относящиеся к рисунку 3 .

(A) Типичные двухфотонные изображения клеток RGL R1 и R2 in vivo (вверху) и их соответствующее изображение апостериорной флуоресценции (внизу).(B) Конфокальные изображения иммунофлуоресценции одних и тех же клеток GFAP + / tdTomato + на разной глубине, подтверждающие их идентичность RGL. Масштабные линейки: 20 мкм.

Относится к фигуре 4 .

Аннотация генной онтологии (gGOSt, https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) дифференциально экспрессируемых генов (DEG) в Gli1 + RGL после делеции Klf9 .

Благодарности

Мы хотим поблагодарить сотрудников лабораторий Sahay и Goncalves за вклад в эту работу.N.G получила поддержку отделения психиатрии MGH. К.М. проходит стажировку в учебной программе Эйнштейна по исследованиям стволовых клеток, поддерживаемой Фондом стволовых клеток Эмпайр-Стейт в рамках контракта C34874GG Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк. Ю.С. была стипендиатом постдокторантуры Министерства науки Тайваня. D.G, C.H, J.C и A.Z. являются стипендиатами летней стажировки ИСКЧ. В ВИДЕ. выражает признательность за поддержку Премией биоповеденческих исследований Национального института здравоохранения США для новых ученых-новаторов (BRAINS) 1-R01Mh204175, NIH-NIA 1R01AG048908-01A1, NIH 1R01Mh211729-01, NINDS R56NS117529, награды Фонда Джеймса и Одри Фостер за исследования в области медицины. New Scholar in Aging, Фонд Уайтхолла, Премия Inscopix Decode, Премия Независимого Исследователя NARSAD, Филантропическая поддержка семьи Эллисонов, Фонд Blue Guitar, Гарвардский центр нейродиспетчеров / Пилотный грант Центра MADRC, исследовательский грант Ассоциации Альцгеймера, Гарвардский институт стволовых клеток ( ИСКЧ) Грант на развитие и посевной грант ИСКЧ.J.T.G. благодарит за поддержку Национальный институт здоровья США NINDS R56NS117529 и Фонд Уайтхолла. A.S благодарит L. M. S. Sahay за вычитку рукописи.

Стартер и переключатель в сборе (тип СТ-20) 20-3708010 к автомобилю ГАЗ 69

№ 51-3806030-Б
Двухпозиционный переключатель освещения шкал приборов в сборе типа П19.

# 51-3704010
Замок зажигания

# 20-3713300
Выключатель электродвигателя отопителя в сборе

# 76-5205010
Стеклоочиститель в сборе

№ 69-3724037-В
Провод питания стеклоочистителя в сборе

# 69-3702010
Реле регулятора в сборе типа РР20

№ 51-3716010-Г
Фонарь задний в сборе типа ФП-13

# 69-3801010
Комбинация приборов КП12

# 12-3722220
Предохранитель цепей освещения теплового узла (ПР2-Б)

№ 20-3709010-Б1
Центральный узел управления микропереключателем (тип П6-Б2).

№ 51-3724036-А2
Провода стыковки вилки питания указателя температуры, манометра и бензинового указателя в сборе

№ 51-3806020-Б1
Датчик указателя уровня бензина в бензобаке в сборе типа БМ20.

# 541100
Разъем проводов в сборе

$ 56,57

# 69-3713025
Патроны освещения весов приборов в сборе типа ПП1

# 69-3724053
Провод питания сигнальной лампы температуры воды в радиаторе в сборе

# 69-3714200
Свет освещения кабины в сборе типа ФП12-Б

$ 3,54

№ 30-8102010-А
Вентилятор отопителя в сборе

# 69-3724031
Провод к заднему фонарю

№ 51-3705010-Б
Катушка зажигания в сборе типа Б1

# 69-3724064
Провод соединения вилки розетки прицепа с массой

№ 51-3714310-Б
Лампа подкапотная в сборе типа ПД-1

# 67Б-14304-Б
Провод соединения «массы» двигателя с «массой» автомобиля в сборе

№ 69А-3724030-А
Полный жгут проводов на раме в сборе

# 51-3730010
Штепсельная розетка присоединения прицепа пищевого типа ПС-10.

# 51-3707010
Свеча зажигания в сборе (СН4-Г)

№ 51-3712010-Б
Фонарь габаритный в сборе ПФЗ-В

№ 20-3706010-Б
Распределитель в сборе типа Р23

# 51-3808020
Датчик указателя температуры воды в сборе типа ТМ2-А

# 51-3810020
Указатель давления масла в сборе типа ММ-4

№ 20-3701010-А
Генератор 12 в, 18 и в сборе типа Г20

№ 20-3723011-А1
Панель соединительная

№ 69-3724030-А
Полный жгут проводов на раме в сборе

$ 5,89

# 20-3724062
Провод соединения аккумуляторной батареи с «массой» в сборе.

№ 51-3711010-Б1
Фара в сборе типа ФГ2-А2

№ 20-3703011-А
Батарея аккумуляторов в сборе (без электролита, незаряженная 6-СТ-54-ЭМ, ГОСТ 959-51)

# 20-3711045
Втулка уплотнительная

№ 51-3721010-В
Блок сигнальный двухпроводной 12 типа С56-Б

# 12-3808025
Датчик контрольной лампы температуры воды в радиаторе в сборе типа ММ7

№ 69-3724050-А
Провод от аккумуляторной батареи к выключателю стартера в сборе

№ 69-3724015-В
Комплект жгута проводов ГАЗ-69

№ 69-3724015-В
Комплектный жгут проводов в сборе

# 20-3724083
Печать

# 80-3724083
Пломба провода к выключателю стартера

# 51-3715020
Розетка соединительная в сборе (47К)

№ А-14598
Пряжка

# 69-3707050
Кабель свечи зажигания от индукционной катушки до распределителя с глушителем в сборе сопротивления

№ 69-3722010-А2
Блок предохранителей в сборе типа ПР-10-Б.

# 51-3724093
Пряжка крепления жгута проводов в сборе

# 69-3724044
Провод соединения вилки розетки фонаря с массой в сборе

№ 51-3724020-В
Провод кнопки звукового сигнала в сборе

$ 8,25

# 69-3724099
Провод от блока предохранителей к переключателю поворотной фары в сборе

$ 9,07

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

GOST R 52630-2006 eng — 问 共享 资料

ГОСТ Р 52630-2006 на англ.

资料 文件 较大 ， 不 支持 直接 下载 ， 开通 VIP 可 寻找 此 资料。

该 资料 由 网友 上传 ， 极少 部分 内容 可 浏览 试试 查找 其他 资料

剩余 3 页 未 读

[Версия] 所有 资料 为 用户 分享 产生 若 发现 您 的 权利 被 侵害 ， 联系 客服 isharekefu @ iask.сп 我们 尽快 处理。

的 授权 ，

网站 提供 的 党政 主题 相关 内容 (国 сильная ..) 目的 在于 配合 国家 政策 宣传 ， 仅限 个人 学习 分享 使用 目 广告 的 目

历史 搜索

收藏 数量 已达 上限

开通 VIP 可 收藏 更多 资料 哦

立即