Аксон квик киров: Интернет-магазин стройматериалов с доставкой Akson.ru
АКСОН — Получайте кэшбэк от Brevix!
аксон интернет-гипермаркет строительных и отделочных материалов, аксон интернет-гипермаркет все для сада и дома, Akson.ru интернет-магазин стройматериалов, Akson.ru интернет-магазин с доставкой, аксон ярославль, аксон череповец, аксон ярославль интернет магазин, аксон кострома, аксон квик кострома, аксон иваново официальный сайт каталог, аксон квик, интернет магазин аксон, каталог аксон, аксон иваново каталог товаров, аксон каталог товаров, череповец аксон, аксон мебель
| ООО Петровский, г.Санкт-Петербург. посуда | SVOYDOM | 1 | 14.01.2020 13:27 от Shepka |
| ООО Офисмаг-Поволжье, г.Волгоград. сотрудничество от производителя | IV37 | 0 | 19.12.2019 13:41 от IV37 |
| ООО АКТИВ (группа компании «Интеллект Логистик», г.Санкт-Петербург. Контакты отдела закупок | pashkevich22 | 0 | 17.12.2019 08:52 от pashkevich22 |
| ООО «ЕвроХауз», г.Санкт-Петербург. Контакты закупщиков | pashkevich22 | 0 | 17.12.2019 08:49 от pashkevich22 |
| ООО «ЕвроХауз», г.Санкт-Петербург. Контакты закупщиков | pashkevich22 | 0 | 17.12.2019 08:48 от pashkevich22 |
| ИП ИП Катин Е.Г.(1000 мелочей, сеть розничных магазинов), г.Комсомольск-на-Амуре. зпрашиваю почту, есть КП по посуде от производителя | harf | 0 | 27.11.2019 12:11 от harf |
| ООО БЫТТЕХ, г.Санкт-Петербург. Вышлите пожалуйста прайс. На сайте нет цен… | SVOYDOM | 0 | 26.11.2019 18:02 от SVOYDOM |
| ООО Трансазия, г.Краснодар. Актуальные контакты тел. | Imust | 2 | 22.11.2019 07:22 от harbegon |
| ООО Аведекс, г.Красноярск. Контакты КМ Нон-фуд | MarkinIS | 0 | 31.10.2019 12:59 от MarkinIS |
| ИП Юхно (Забайкалбытхим, сеть ЯР), г.Чита. Контакты КМ Нон-фуд | MarkinIS | 0 | 31.10.2019 12:56 от MarkinIS |
| ООО Мастер-Трейд Опт, г.Хабаровск. Поставка детской обуви. | yulia.ibragimova | 1 | 25.10.2019 18:17 от YA_IGOREVNA |
| ООО ТойРу, г.Москва. Сотрудничество | Vsevolodmsk | 0 | 15.10.2019 15:49 от Vsevolodmsk |
| ООО Дарси, г.Москва. Минимальные цены | Shest | 0 | 03.10.2019 14:37 от Shest |
| ЗАО Хрустальный звон, г.Владимир. запрос | artem chernikoff | 2 | 01.10.2019 09:34 от Grenberg |
| ИП Антропов Александр Владимирович, г.Чита. Сотрудничество | a.gromov | 0 | |
| ООО Вестер сеть, г.Калининград. закупка кожгалантереи и текстиля | ilmikhajl | 0 | 18.07.2019 14:15 от ilmikhajl |
| ООО Главторг (Оптовая база «Шарташская»), г.Екатеринбург. Трикотаж | Нати | 1 | 16.07.2019 06:21 от NoskiNN |
| ООО Той.ру, г.Нижний-Новгород. Той.ру | YANA.MAMAYKOVA | 1 | 08.07.2019 10:58 от titu2012 |
| ООО Тренд, г.Санкт-Петербург. прайс | viwanisko | 0 | 01.07.2019 11:46 от viwanisko |
| ООО 1 НЬЮ, г.Санкт-Петербург. дистрибьюция | development73 | 0 | 26.06.2019 13:57 от development73 |
| ООО Комус, г.Санкт-Петербург. Контакты закупщика по предметам интерьера (фоторамки) Комус | lyuba2812 | 0 | 10.06.2019 12:21 от lyuba2812 |
| ООО ТД Кинетика, г.Москва. Прайс | A1ex_77 | 10.02.2019 08:45 от A1ex_77 | |
| ООО ТД Сияние чистоты, г.Москва. ТД Сияние чистоты | Shalunishka | 0 | 08.02.2019 07:35 от Shalunishka |
| ООО ГринПаркМастер, г.Москва. Закупки сезон 2019 | faithful man | 2 | 23.01.2019 15:22 от Marita.Marina |
| ЗАО Иркутскстройоптторг, г.Иркутск. Продам товары для дома (посуда, текстиль, хозка) | Shepka | 0 | 07.12.2018 10:26 от Shepka |
| ООО СибРегионОпт, г.Иркутск. Продам товары для дома (посуда, текстиль, хозка) | Shepka | 0 | 07.12.2018 10:08 от Shepka |
| ООО Дуэт-Иркутск, г.Братск. отзывы о компании | softi | 0 | 29.11.2018 02:38 от softi |
| ООО Армада, г.Кострома. Армада Кострома Аксон | jessnail | 0 | 28.11.2018 10:07 от jessnail |
| ЗАО ТАЙДИ СИТИ, г.Москва. вопрос | tdastra | 1 | |
| ИП Буцык М.М., г.Владивосток. Примбытхим ИП Буцык М.М. | Akris | 0 | 21.11.2018 01:36 от Akris |
| ООО Россмед-Сервис, г.Киров. Контакты | richards | 0 | 20.11.2018 12:53 от richards |
| ООО Микатекс, г.Москва. сотрудниччество | Kolgotochka | 0 | 20.11.2018 11:05 от Kolgotochka |
| ИП Магомедова Наида Ибрагимовна ИП, г.Санкт-Петербург. Напишите пожалуйста адрес эл.почты. | Alex2017 | 1 | 19.11.2018 13:56 от Alex2017 |
| ООО Паучок, г.Сочи. Компания жива? | asyazhu | 0 | 08.11.2018 09:51 от asyazhu |
| ООО БЕЛОЕ СОЛНЦЕ, г.Москва. запрос прайса | nadezda125635 | 1 | 24.10.2018 08:09 от Sales a Man |
| ООО ООО «Тсин Эст Трейд», г.Москва. Гуслица- бумажная продукция, Хорека | g.m.guslitsa | 3 | 08.10.2018 08:50 от den121984 |
| ООО Пластиктрейд, г.Краснодар. Сотрудничевство | 89522124846 | 0 | 18.09.2018 12:37 от 89522124846 |
| ИП Тунцева Р.Ю (biowin39.ru) (milomylo.ru), г.Москва. Интересный товар, надежный поставщик. Торговый дом бытовой техники | stiv_ig | 0 | 14.09.2018 09:29 от stiv_ig |
| ООО Дали-Юг, г.Ростов-на-Дону. Сотрудничество | e1_kuli | 0 | 10.09.2018 14:51 от e1_kuli |
| ООО ИНТЕР-ХОУМ, г.Ростов-на-Дону. Сотрдуничество | e1_kuli | 0 | 10.09.2018 14:49 от e1_kuli |
| ООО Магнат Трейд Энтерпрайз, г.Волгоград. Сотрудничество | BIO.FLOR.LINTEK | 0 | 24.08.2018 12:34 от BIO.FLOR.LINTEK |
| ООО ХимБытТорг, г.Самара. Контакты | optik1 | 1 | 17.08.2018 14:11 от petr_p |
| ООО Дали-Юг, г.Ростов-на-Дону. Запрос прайса | Anton Chebanov | 0 | 25.07.2018 12:42 от Anton Chebanov |
| ООО Ору Джапан ( В-лазер), г.Владивосток. контакты для сотрудничества http://v-lazer.com | Foxgamer | 0 | 29.06.2018 09:51 от Foxgamer |
| ООО Мир дома, г.Сочи. Почта для коммерческого предложения | ivaolga | 0 | 19.06.2018 08:57 от ivaolga |
| ИП Антропов Александр Владимирович, г.Чита. Контакты закупщиков | almaznn | 0 | 04.06.2018 15:08 от almaznn |
| ООО Квик Техномир, г.Тула. Нужны контактные телефоны офиса. | Belikova | 1 | 24.05.2018 09:47 от lazy_alex |
| ООО РУСАГРОХИМ, г.Москва. ТОВАРЫ | darkrise | 0 | 11.05.2018 15:41 от darkrise |
| ООО Ворлд Тобакко Ориджинал (WTO (World Tobacco Original) ), г.Москва. ТАБАК | darkrise | 0 | 11.05.2018 15:38 от darkrise |
| ИП Первый джинсовый склад, г.Москва. ДЖИНСЫ | darkrise | 0 | 11.05.2018 15:36 от darkrise |
|
00117
адрес избирательно
адрес издательства
адрес икона помощн
адрес инд. 129626 г. мо
адрес инспекции тр
адрес института ге
адрес института пу
адрес интернет каф
адрес интим салона
адрес ирландских п
адрес итальянского
адрес ифнс 29 г моск
адрес ифнс №27 юзао
адрес ифнс по г эле
адрес к телекм г. кр
адрес кадровых аге
адрес калининськог
адрес кардиологиче
адрес кассы финэйр
адрес кафе афродит
адрес кафе палагин
адрес качановской
адрес киевского ра
адрес кинотеатра к
адрес кинотеатра э
адрес китайских ав
адрес клиники revici в
адрес клиники инви
адрес клиники федо
адрес клуба dinco в ан
адрес клуба знаком
адрес клуба подзем
адрес клубов знако
адрес кожно-венеро
адрес колонии №3 в
адрес комиссионных
адрес компании henders
адрес компании аэр
адрес компании кол
адрес компании рос
адрес компании юко
адрес кондратьевск
адрес консульства
адрес консульства
адрес консульства
адрес консульство
адрес концерн авро
адрес корпорация д
адрес кпрф в нижнем
адрес красного кре
адрес кру в запорож
адрес кукольного д
адрес курьерской с
адрес лагеря орлен
адрес ледового дво
адрес лексус центр
адрес леруа мерлен
адрес лиу г. нижний
адрес логистика тр
адрес лютеранской
адрес магазин swarovski
адрес магазин левш
адрес магазин с пне
адрес магазина adidas
адрес магазина centrob
адрес магазина ikea в
адрес магазина motivi
адрес магазина saunala
адрес магазина zara в
адрес магазина ако
адрес магазина арх
адрес магазина биб
адрес магазина в ки
адрес магазина вес
адрес магазина гид
адрес магазина дзи
адрес магазина здо
адрес магазина инт
адрес магазина кен
адрес магазина кос
адрес магазина лет
адрес магазина мар
адрес магазина мед
адрес магазина мир
адрес магазина нов
адрес магазина орд
адрес магазина пла
адрес магазина псж
адрес магазина роз
адрес магазина све
адрес магазина сне
адрес магазина сте
адрес магазина тер
адрес магазина три
адрес магазина фол
адрес магазина цен
адрес магазина экс
адрес магазина яма
адрес магазинов в с
адрес магазинов ме
адрес магазинов са
адрес магазинов ян
адрес макдональдс
адрес марфин банк в
адрес мвд г. усть ку
адрес мебельного б
адрес меги + в росто
адрес медицинских
адрес международно
адрес металл профи
адрес миграционная
адрес мид украины г
адрес министерства
адрес министерства
адрес мирового суд
адрес мировых судь
адрес многофункцио
адрес молочной кух
адрес москва, рубле
адрес мотовилихинс
адрес мрэо в г елец
адрес мту интел в м
адрес музея булгак
адрес музея парово
адрес музыкального
адрес мусорного по
адрес н новгород нп
адрес налоговая ин
адрес налоговой в г
адрес налоговой ин
адрес налоговой ин
адрес налоговой сл
адрес наркоконтрол
адрес народный кон
адрес не зависимой
адрес немецкого по
адрес нии прометей
адрес новая почта в
адрес новой почти в
адрес номер телефо
адрес нотариуск ле
адрес нумизматичес
адрес оао лискигаз
адрес оати западно
адрес областного д
адрес областной на
адрес обучающих це
адрес общества сад
адрес овд г. экибас
02214
салон ланос солано
салон лечения и окр
салон люкс в оку це
салон магазин косм
салон магазинов ча
салон мазда в г. тюм
салон маргарита + в
салон мастер и марг
салон мебели + в чеб
салон мебели в г вл
салон мебели гармо
салон мебели катал
салон мебели нижег
салон мебели фавор
салон мегафон в нер
салон меха браво г
салон мечта невест
салон митсубиси в с
салон мобильных те
салон мото сузуки в
салон мтс у старой
салон мягкой мебел
салон на светланов
салон натальи каро
салон нива шевроле
салон ниссан в спб
салон нокиа + в белг
салон обоев винтаж
салон обуви монро в
салон оками моторс
салон опель + в тюме
салон оптики ип буг
салон ортопедическ
салон очков loox в са
салон парикмахерск
салон парикмахерск
салон парикмахерск
салон пежо + в иркут
салон персона о нар
салон платьев + в мо
салон по пирсингу в
салон подержанных
салон постеров в са
салон продаж автом
салон продажи фоль
салон райский угол
салон рено + в стерл
салон рено меган г
салон рукоделия в т
салон с. лакс в жуле
салон свадебная мо
салон свадебной об
салон свадебный ра
салон свадебных пл
салон свадебных пл
салон свадебных пл
салон свадебных пр
салон связи west-telecom
салон связи мтс в р
салон связи центро
салон ситроен + в кр
салон сотовой связ
салон сотовоых мел
салон стар нейлс в
салон студия красо
салон тай спа в бел
салон тату + в долго
салон тату в городе
салон тату мэрилин
салон татуировки у
салон татуировок с
салон тканей брави
салон транстехсерв
салон у натали днеп
салон фабрика грез
салон фольксваген +
салон форд + в новок
салон форфоровых к
салон хендай + в тол
салон хонда мотоци
салон хюндай акцен
салон цветов и пода
салон цветы в больш
салон часов женева
салон шарм н белой
салон шевроле в г с
салон шкода + в симф
салон штор в г желе
салон штор дивница
салон штор софья и
салон эвелина в кра
салон элитной бижу
салон эротического
салон эротического
салон ю бьюти на го
салона в чертежах me
салоне красоты в хм
салоникрасоты инь
салон-магазин офис
салонны фильтр в хо
салонный фильтр gs300
салонный фильтр в н
салонный фильтр на
салон-парикмахерск
салон-услуг шпильк
салоны daewoo nexia в каз
салоны mitsubishi + в мос
салоны wella professional в
салоны авто ваз в с
салоны автомобилей
салоны автомобилей
салоны английской
салоны белорусской
салоны в euro truck simulato
салоны в курске по
салоны в перми авто
салоны ваз + в росто
салоны вечерней мо
салоны вечерних пл
салоны вечерних пл
салоны выпускных п
салоны дающие плат
салоны для автомоб
салоны для собак в
салоны екатеринбур
салоны и парикмахе
салоны интимного п
салоны итальянской
салоны китайских т
салоны косметики +
салоны красоты + в д
салоны красоты + в п
салоны красоты sharm’l
салоны красоты биг
салоны красоты в ан
салоны красоты в бр
салоны красоты в г
салоны красоты в г.
салоны красоты в г.
салоны красоты в го
салоны красоты в го
салоны красоты в до
салоны красоты в из
салоны красоты в ки
салоны красоты в ку
салоны красоты в ми
салоны красоты в мо
салоны красоты в но
Ресурс из трехмерной электронной микроскопии нейропиля гиппокампа для обучения пользователей и разработки инструментов
Источник и обработка ткани
Все процедуры следовали рекомендациям NIH по гуманному уходу и использованию лабораторных животных. Самцу крысы линии Long-Evans массой 310 г (77-й постнатальный день) перфузировали через сердце под глубокой пентобарбитальной анестезией 2% параформальдегида, 2,5% глутаральдегида и 2 мМ CaCl 2 в 0,1 М какодилатном буфере при pH 7. .35, 37 ° C и 4 фунта на кв. Дюйм, как описано ранее 37 . Мозг оставляли без изменений в черепе на 1 ч, а затем удалили гиппокамп. Сразу после вскрытия гиппокамп измельчали до толщины 400 мкм. Срезы промывали при перемешивании в буфере, а затем замачивали на 1 час в 1% OsO 4 с 1,5% ферроцианидом калия, а затем на 1 час в 1% OsO 4 . Затем их промывали в буфере, замачивали в 30% и 50% этаноле в течение 10 минут каждый, погружали на 1 час в 1% уранилацетат в 70% этаноле при комнатной температуре, дегидратировали этанолом и оксидом пропилена, заливали в Epon и отверждали в течение 48 ч при 60 ° C.Серии были вырезаны согласно опубликованным нами протоколам 57 . Вкратце, инструмент для обрезки алмазов (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) использовался для подготовки небольших трапециевидных участков шириной ~ 200 мкм и высотой 30-50 мкм. Последовательные тонкие срезы вырезали при настройке ~ 50 нм на ультрамикротоме Reichert Ultracut E. Серийные срезы собирали на слот-сетках, покрытых формваром или пиолоформом (Synaptek), и подвергали контрастному окрашиванию насыщенным этанольным уранилацетатом, а затем цитратом свинца Рейнольдса, каждый в течение 5 мин.Индивидуальные сетки помещали в сеточные кассеты и хранили в пронумерованных желатиновых капсулах. Изготовленные на заказ кассеты (ранее использовавшиеся для визуализации в Harris и др. 57 ) были установлены на вращающемся столике JEOL для получения однородной ориентации секций на соседних решетках. Серии были сфотографированы на электронном микроскопе JEOL 1200EX или 1230 (JEOL, Peabody, MA). Первоначальные увеличения были 5000–6000. Для будущей работы мы рекомендуем сканирующий электронный микроскоп, работающий в режиме пропускания (tSEM), как описано в нашей недавней публикации 58 .Качество изображения аналогично при сохранении размера пикселя 2 нм или меньше. (Это разрешение необходимо для визуализации микротрубочек для количественной оценки, как независимая мера калибра дендритов, необходимая в наших экспериментах.) Кроме того, с помощью новой системы tSEM можно полуавтоматически собирать поля изображения гораздо большего размера с разрешением 2 нм (или меньше), с большой экономией времени и затрат для пользователя 58 .
Электронная микроскопия
Три объема были сфотографированы из середины s.radiatum, каждый ~ 150-200 мкм от слоя сомы пирамидных клеток гиппокампа CA1 (Fig. 1b, Table 1 (доступно только онлайн)). В этом отчете каждый том упоминается по его центральному объекту, то есть корешку, наклонному дендриту или апикальному дендриту. 60 изображений объема позвоночника были получены из цифровых сканирований оригинальных ЭМ-негативов из серии 24 в нашей предыдущей публикации (k24, таблица 1 (доступна только в Интернете)) 37 . Дополнительные серийные срезы были вырезаны из другого блока того же животного, и два поля изображений были сфотографированы из этих срезов (R34CA1-B_S12 относится к Rat 34 CA1, блок B, серия 12, таблица 1 (доступна только в Интернете)).Одно поле изображения было сосредоточено на наклонном дендрите и было сфотографировано через 91 серийный срез. Другое поле изображения было сосредоточено на апикальном дендрите и сфотографировано с помощью 194 серийных срезов.
Таблица 1 Объемы изображений и 3DEMИспользование Reconstruct для выполнения анализа 3DEM
Файлы данных, калибровка, выравнивание изображения, оценка толщины сечения, трассировка, присвоение имен, 3D-реконструкция и количественный анализ были созданы с использованием нашего специально разработанного программного обеспечения Reconstruct, которое находится в свободном доступе вместе с подробным руководством пользователя (Data Citation 1) 35,59 .
Файлы данных
В руководстве Reconstruct подробно описаны три типа файлов данных. Вкратце, они включают: 1) Исходные файлы изображений. 2) Файлы трассировки с информацией о координатах трассы, цветах, формах и т. Д., А также параметры выравнивания изображения, контрастности и яркости (имя серии.номер_секции). 3) Один файл серии (seriesname.ser) содержит информацию, которая применима к последовательным разделам, например, Z-кривые (линейные измерения, охватывающие несколько разделов), палитру кривых, информацию о калибровке и любую другую информацию, имеющую отношение к вся серия.
Контрастность и яркость
Мы производим цифровую оптимизацию изображений по яркости и контрасту в Reconstruct, чтобы визуализировать интересующие структуры во время трассировки. Эти изменения вносятся в файлы трассировки и не изменяют окончательно исходные изображения; следовательно, эти свойства были соответствующим образом скорректированы во время идентификации и измерения различных структур (например, постсинаптической плотности, полирибосом по сравнению с микротрубочками).
Выравнивание изображений
Для выравнивания изображений использовались стандартные протоколы, подробно описанные в руководстве Reconstruct.Вкратце, пара срезов без артефактов (например, складок, разрывов, пятен или пыли) была выбрана в середине серии. Начиная с этих срезов, реперные следы помещали на поперечные срезы микротрубочек или митохондрий в одном и том же месте, и применяли функцию линейного совмещения для совмещения изображений. Одна за другой последовательные пары были выровнены вверх и вниз по серии. Качество совмещения оценивалось по смешиванию или мерцанию между соседними изображениями. В хорошо выровненной серии смешанные изображения выглядели как одно хорошо сфокусированное изображение.При неправильном выравнивании смешанные изображения выглядели размытыми или как двойные изображения в областях с неоптимальным выравниванием. В этих регионах были добавлены дополнительные реперные точки для улучшения выравнивания. Если смешанные изображения не могли быть правильно выровнены с помощью линейного инструмента в Reconstruct, проблемный участок пропускался, а вместо этого выравнивались два его соседних участка. Обычно участки, которые невозможно выровнять, имели заметные дефекты секционирования (например, разрывы, складки или артефакты сжатия).Инструменты деформального или квадратичного совмещения использовались для совмещения каждого дефектного участка с его соседними участками. Эти крайние совпадения дефектных участков не распространялись на всю серию. Координаты центровки сохранялись в файлах трассировки; в исходные файлы изображений не было внесено никаких изменений, так как выравнивание применяется только при просмотре разделов в Reconstruct. Копии выровненных изображений экспортировали, с визуализацией следов или без таковой, для создания фигур.Выровненные изображения можно аналогичным образом импортировать в другие программы просмотра и реконструкции. Эти стратегии задокументированы в руководстве Reconstruct.
Калибровка
Размер пикселя был достигнут относительно реплики дифракционной решетки (квадраты 0,463 мкм от Ernest F. Fullam, Latham, NY), которая была сфотографирована с каждой серией. Функция калибровки в Reconstruct использовалась для расчета среднего размера пикселя по полю изображения, в результате чего получилось пространственное разрешение ~ 2,2 нм / пиксель.Исходные изображения TIFF или BMP также доступны для анализа изображений или использования в других программах (Data Citation 1) 56,60,61 .
Оценка толщины среза
Толщина среза была рассчитана путем деления диаметров продольно разрезанных митохондрий на количество разделов, которые они охватили 62 . В каждой выровненной серии были идентифицированы десять продольно разрезанных митохондрий и измерены их диаметры (митодии ## — это имя, присвоенное следу диаметра каждой использованной митохондрии).Ширину митохондрии измеряли в одном и том же месте на каждой секции, чтобы определить максимум (а именно ее диаметр), а также определить, сколько секций она охватывает. Баллы по краям для первого и последнего участков каждой митохондрии были определены в соответствии с установленными критериями: 0,25 для светло-серого без видимых крист, 0,50 для среднего серого без крист, 0,75 для черного без крист и 1, когда митохондриальные кристы были видны 62 . Для каждой митохондрии толщина среза оценивалась как диаметр, деленный на количество пересеченных участков; низкие и высокие значения отбрасывались, а остальные значения усреднялись.Расчетная толщина среза составила 49 нм для наклонного и апикального объемов дендритов, которые были сфотографированы из одних и тех же серийных срезов. Толщина среза объема корешка (который был сфотографирован из другого набора серийных срезов) была рассчитана и составила 59 нм (таблица 1 (доступна только в Интернете)).
Объемы изображений
Невыровненные объемы изображений были подвержены различным эффектам секционирования и воздействия луча в электронном микроскопе. Следовательно, функции выравнивания Reconstruct использовались для выравнивания объектов относительно центральной секции, которая не имела очевидных артефактов.Выровненные области доменов изображения сравнивали с исходными невыровненными областями изображения, что приводило к корректировке в среднем на ~ 10–15% для отдельных наклонных или апикальных дендритных изображений в серии (таблица 1 (доступна только в Интернете)). Объем корешка был получен из серии негативов ЭМ, которые были отсканированы в цифровом виде и выровнены с использованием старой версии Reconstruct. Следовательно, выровненный объем изображения корешка не был релевантной мерой настройки изображения, потому что домены охватывали больше, чем сам объем изображения.Мы повторно отсканировали и разместили новые невыровненные изображения из исходных негативов объема корешка, чтобы эту серию изображений также можно было использовать для тестирования процедур автоматического выравнивания и сегментации.
Плотно реконструированные объемы
Все дендриты, аксоны и астроглиальные процессы были прослежены в субдоменах каждого объема изображения для создания плотно реконструированных объемов (DR, таблица 1 (доступна только онлайн)). Объем корешка занимал 42 секции, при этом общий выровненный объем составлял около 9.8 мкм 3 . Наклонный объем дендрита занимал 70 последовательных срезов с общим выровненным объемом 43,2 мкм 3 . Апикальный объем дендрита занимал 101 последовательный участок с общим выровненным объемом 178,2 мкм 3 . Таким образом, в каждом случае значительный объем изображения окружает плотно реконструированные объемы.
Трассировка и присвоение имен
Таблица 2 (доступна только в интерактивном режиме) перечисляет имя и тип трассировки для каждого объекта в томах аварийного восстановления. Маркеры границ объема использовались для обозначения границ одних и тех же полей от раздела к разделу томов DR.Каждому дендритному сегменту и несвязанному фрагменту позвоночника был присвоен уникальный номер. Точно так же аксонам были присвоены уникальные номера с суффиксами для идентификации их типа (возбуждающий, тормозной или неидентифицированный). Синапсы были названы в соответствии с их номерами дендритов и аксонов. Имена синапсов на выступах с более чем одним синапсом (например, разветвленные или мультисинаптические шипы) были дополнительно дополнены буквами «a», «b», «c» и т.д. ‘для’ снаружи ‘.Субклеточные объекты были названы в соответствии с дендритным сегментом, в котором они были обнаружены, с указанием типа и номера объекта. Например, первая митохондрия, идентифицированная в дендритном сегменте d008, была названа d008mito01. Наконец, глиальные отростки были названы в соответствии с их характеристиками как астроглия (чистая цитоплазма и гранулы гликогена), микроглия (темная цитоплазма и лизосомы) и олигодендроциты (образующие миелин).
Таблица 2 Структура именования и тип трассировки для идентификации и количественной оценки в Reconstruct и сгруппированы для визуализации в визуализации OCPФорма штампа — это один из инструментов трассировки, которому можно присвоить уникальное имя и форму для упрощения идентификации объектов или местоположений.Одной и той же форме можно присвоить разные имена, например d ### p ##, где d — это дендрит, а p — конкретное начало выступа. Форма может быть выбрана пользователем, как описано в руководстве пользователя Reconstruct.
Z-трассы прослеживаются через последовательные секции для вычисления продолжительности процессов или объектов в 3D 36 . Их можно использовать, например, для вычисления длин дендритных или аксональных сегментов. Трассы Z обычно отслеживаются, начиная с начального участка вверх, а затем с последнего участка вниз, а затем усредняются, обычно по 3–4 трассам.Z-трассы хранятся в файле .ser и легко доступны для анализа, когда серия загружается в Reconstruct.
Списки объектов и трассировок
Reconstruct обеспечивает вывод объектов, трасс и других списков в формате .csv, включая количественный анализ объемов объектов, площадей поверхностей, плоских площадей, счетчиков, длин, площадей, периметров и т. Д., Которые могут быть включены в электронные таблицы для описательного и статистического анализа. Каждый из этих расчетов описан в руководстве пользователя.
3D-реконструкции
Reconstruct также предоставляет множество подходов для отображения 3D-сцен. В руководстве пользователя описывается, как получить поверхности Буассонна (используемые для трехмерных сцен в этом отчете), блоки определенного размера (используемые для установки абсолютных размеров масштабных кубов в этом отчете) и сферы (определенных размеров, используемые для представления полирибосом в этот отчет). Также доступны другие стили, такие как трассировки, пластины трассировки и цилиндры.
Визуализация в Open Connectome Project
Управление захватом данных и хранением
EM-изображения и аннотации были экспортированы из Reconstruct и загружены в пространственные базы данных OCP (т.е., базы данных, поддерживающие запросы в трехмерном пространстве). Данные экспортировались путем чтения файлов с помощью сценариев MATLAB для чтения проектов Reconstruct (http://GitHub.com/openConnectome/ReconstructImport), преобразования контуров аннотаций в плотные пространственные массивы, объединения аннотаций и их группировки по классам (аксон, дендриты, глия, и синапсы), а также вывод файлов изображений для EM и каждой группы аннотаций. Скрипты загрузки на Python собирают несколько файлов изображений в трехмерный объем, который отправляется в веб-службы OCP.После приема OCP построил иерархию изображений с несколькими разрешениями, которая рекурсивно масштабировала данные в два раза в плоскости изображения (размеры x и y) при каждом более низком разрешении. Данные EM и каждая группа аннотаций определяют проект OCP , который можно запрашивать, загружать или визуализировать независимо. Все проекты были совместно зарегистрированы в наборе данных OCP , который описывает общую пространственную область.
Веб-визуализация с помощью CATMAID
Пространственные базы данных в OCP можно визуализировать через веб-браузер с помощью инструментария Collaborative Annotation Toolkit для больших объемов данных изображений (CATMAID, http: // catmaid.org), разработанный Saalfeld et al. 63 CATMAID представляет трехмерные данные как последовательные изображения, представляя одно изображение (в исходной плоскости изображения) за раз в браузере. Интерфейс включает элементы управления панорамированием и масштабированием, позволяющие перемещаться по данным в иерархии разрешения. CATMAID включает в себя возможность наложения слоев аннотаций поверх электромагнитных данных и элементы управления для настройки прозрачности слоев.
Доставка и кэширование данных для визуализации
CATMAID запрашивает данные от OCP в виде плиток, обычно размером 512 на 512 пикселей, с заданным разрешением.OCP предоставляет веб-службы для запросов отдельных листов, которые извлекают плоскости изображений из объемных баз данных. Чтобы ускорить визуализацию при доступе к соседним срезам или при многократном просмотре данных, OCP управляет иерархией кешей. Во-первых, тайловый кеш в памяти поддерживается в кластере данных OCP с использованием memcached (http://memcached.org/). Кэш содержит наиболее часто используемые тайлы в зависимости от объема памяти кластера. Запросы плиток, которые не попадают в кэш памяти, обрабатываются по запросу веб-сервером.При обслуживании такого промаха кэша OCP должен прочитать объем данных вокруг запрошенного среза, потому что данные хранятся в трехмерных кубоидах. OCP берет весь объем данных, преобразует его в срезы и сохраняет в дисковом кэше, который называется тайловым кешем OCP (доступен по адресу https://github.com/openconnectome/ocptilecache). Мы загрузили кеш диска, используя асинхронный фоновый процесс. Этот подход заполняет кеш без замедления пользовательского интерфейса. Запросы к соседним областям данных извлекают данные из дискового кеша (например,g., при пролистывании серийных разделов в том же месте). Это позволяет избежать избыточного ввода-вывода и вычислений; данные считываются один раз и отображаются один раз. Дисковый кеш развертывается независимо от баз данных тома. Мы развертываем OCPtilecache на независимом оборудовании, чтобы снизить нагрузку на кластер базы данных. Кэш также можно развернуть локально для клиентов, чтобы данные можно было получать по сетям с низкой задержкой. При такой настройке OCPtilecache служит сетью распространения контента.
Данные общедоступны через веб-службы OCP RESTful для загрузки и интенсивного анализа данных 29 и взаимодействуют с инструментами OCP, такими как конвейеры компьютерного зрения (CAJAL, https: // github.com / openconnectome / ocptilecache) и веб-визуализацию, такую как CATMAID, как указано выше.
Доставка данных
Доступ к веб-службам можно получить программно с помощью инструментов анализа, ориентированных на пользователя, таких как Python, Matlab и R, что позволяет ученым интерактивно получать доступ к данным и метаданным через предпочитаемую ими аналитическую платформу. Веб-службы OCP реализуют широкий спектр запросов с большим объемом данных, которые вычисляют пространственный и статистический анализ больших данных в кластере серверов и возвращают ответы меньшего размера, которые были обработаны, отфильтрованы или иным образом обогащены.Таким образом, OCP реализует платформу, которая поддерживает исследовательский анализ данных в петауровне через Интернет.
Доступность кода
В настоящее время существует три подхода для получения доступа к файлам выравнивания и трассировки Reconstruct (Data Citation 1, Tools), включая Reconstruct, Fiji / TrakEM2 и OCP. Здесь мы кратко опишем, как получить доступ к полезному коду для управления этими данными в будущем.
Reconstruct
Немедленный подход — загрузить программное обеспечение Reconstruct напрямую и следовать инструкциям по загрузке изображений и файлов трассировки и серий и использовать его, как описано в руководстве и выше.Самая надежная версия программы Reconstruct — это 32-битная версия 1.1.0.1, работающая на платформе Microsoft Windows. Исполняемый файл для программного обеспечения Reconstruct и руководство пользователя, а также подробные инструкции по доступу ко всем файлам данных и соответствующему программному обеспечению доступны на OCP (Data Citation 1, Tools). Новому пользователю требуется несколько минут, чтобы начать использовать Reconstruct для просмотра и взаимодействия с существующими данными, следуя инструкциям «Быстрый старт» в главе 1 руководства. Примерно через 1-2 часа новый пользователь может стать достаточно опытным, чтобы начать добавлять новые трассы и визуализировать объекты в 3D.Очевидно, что для того, чтобы стать экспертом в использовании всех инструментов, имеющихся в Reconstruct, требуются более постоянные усилия. Существует всемирная группа пользователей, и многочисленные лаборатории загрузили и опубликовали это программное обеспечение (см. Примеры http://synapseweb.clm.utexas.edu/).
Данные Reconstruct были загружены в OCP для отображения в браузере, как описано выше и далее в этом документе. Доступны скрипты MATLAB для чтения файлов проекта Reconstruct (http://GitHub.com/openConnectome/ReconstructImport), и их можно найти по ссылке (Data Citation 1).Кроме того, сейчас ведутся работы по обновлению Reconstruct для 64-битных машин. 32-битный исходный код доступен по запросу. Исходные необработанные изображения и файлы трассировки Reconstruct хранятся для дальнейшего изучения и анализа (Data Citation 1).
Reconstruct to Fiji / TrakEM2
Fiji / TrakEM2 включает плагин, который считывает и отображает проект Reconstruct (этот плагин http://fiji.sc/Reconstruct_Reader автоматически загружается в текущие версии Fiji). Чтобы загрузить проект Reconstruct, сначала загрузите и извлеките соответствующие файлы проекта (http: // openconnecto.меня / harrisdata /). Откройте Fiji и в раскрывающемся меню «Файл» выберите «Импорт -> Читать проект реконструкции». Найдите и выберите файл .ser для проекта, который вы хотите открыть. Fiji загрузит проект Reconstruct и отобразит его с помощью TrakEM2 на Фиджи. В настоящее время TrakEM2 не поддерживает применение нелинейных выравниваний, поэтому, если деформальные или квадратичные выравнивания использовались в некоторых секциях в Reconstruct, их нужно было бы повторно выровнять в TrakEM2, что верно для некоторых секций в наборах апикальных и наклонных объемов.Поскольку проекты Reconstruct хранят изображения и аннотации отдельно от преобразований выравнивания, контуры в каждом разделе остаются правильно выровненными с нижележащим изображением.
Reconstruct to Open Connectome
Open Connectome сделал доступным несколько скриптов Matlab на GitHub (https://github.com/openconnectome/ReconstructImport). Скрипты конвертируют проекты Reconstruct в форматы файлов, подходящие для загрузки в Open Connectome. Проект реконструкции состоит из набора необработанных изображений и соответствующих файлов XML, каждый из которых содержит преобразования выравнивания и контраста вместе с аннотациями контуров для этого изображения.Во-первых, преобразования должны быть применены к файлам необработанных изображений. Кроме того, контуры в файлах XML должны быть преобразованы в файлы PNG, где каждому пикселю соответствует номер, который является уникальным идентификатором для каждого контура. Кроме того, сценарии могут объединять изображения аннотаций для более быстрой загрузки в базу данных Open Connectome. Весь код задокументирован в файле README.md, который публикуется вместе с кодом импорта Reconstruct на GitHub.
Загрузка данных Open Connectome
Помимо веб-визуализации, Open Connectome поддерживает загрузку данных непосредственно с веб-адресов.Доступны инструкции по загрузке данных, включая поддерживаемые URL-вызовы (Data Citation 1, Tools). Open Connectome также предоставляет CAJAL, программный пакет, который позволяет пользователям Matlab загружать наборы данных Open Connectome и взаимодействовать с ними. Последняя версия CAJAL доступна на GitHub (https://github.com/openconnectome/CAJAL). Доступен пример сценария для загрузки и визуализации данных (Data Citation 1, Tools).
Появление быстрого астроцитарного компонента при визуализации нервной активности с помощью чувствительного к напряжению красителя | Молекулярный мозг
Хилл А.Дж., Джонс Н.А., Уильямс К.М., Стивенс Г.Дж., Уолли Б.Дж. Разработка многоэлектродного скрининга противосудорожных препаратов в острых срезах головного мозга крыс. J Neurosci Methods. 2010; 185: 246–56.
CAS PubMed Google Scholar
Shoham D, Glaser DE, Arieli A, Kenet T, Wijnbergen C, Toledo Y, et al. Визуализация корковой динамики с высоким пространственным и временным разрешением с новыми синими красителями, чувствительными к напряжению. Нейрон. 1999; 24: 791–802.
CAS PubMed Google Scholar
Зепеда А., Ариас С., Сенгпиль Ф. Оптическое отображение собственных сигналов: последние разработки в методологии и ее приложениях. J Neurosci Methods. 2004; 136: 1–21.
PubMed Google Scholar
Chemla S, Chavane F. Визуализация чувствительных к напряжению красителей: обзор техники и модели. J Physiol Paris. 2010; 104: 40–50.
CAS PubMed Google Scholar
Пал I, Нитрай Дж., Кардос Дж., Хейя Л. Нейроны и астроглии коррелируют лежащий в основе пространственно-временный внутренний оптический сигнал в срезе гиппокампа крысы. PLoS One. 2013; 8, e57694.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Кодзима С., Накамура Т., Нидаира Т., Накамура К., Ооаши Н., Ито Е. и др. Оптическое обнаружение синаптически индуцированного транспорта глутамата в срезах гиппокампа.J Neurosci. 1999; 19: 2580–8.
CAS PubMed Google Scholar
Chen-Bee CH, Agoncillo T, Lay CC, Frostig RD. Оптическая визуализация функции мозга с использованием внутренних сигналов с использованием коротких интервалов доставки стимулов. J Neurosci Methods. 2010; 187: 171–82.
PubMed Central PubMed Google Scholar
MacVicar B, Hochman D. Визуализация синаптически вызванных собственных оптических сигналов в срезах гиппокампа.J Neurosci. 1991; 11: 1458–69.
CAS PubMed Google Scholar
Эрикссон Д., Томпа Т., Роланд П.Е. Нелинейные скорости воспламенения популяции и сигналы чувствительных к напряжению красителей в визуальных областях 17 и 18 для кратковременных стимулов. PLoS One. 2008; 3, с2673.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Гринвальд А., Манкер А., Сигал М. Визуализация распространения электрической активности в срезах гиппокампа крысы с помощью чувствительных к напряжению оптических датчиков.J Physiol. 1982; 333: 269–91.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Гринвальд А., Шохам Д., Шмуэль А. Оптическое изображение корковой архитектуры и динамики in vivo. В кн .: Современные методы исследования нейробиологии. Под редакцией Windhorst U, Johansson H. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 1999 г. 893–969.
Чанг П.Й., Джексон МБ. Неоднородные пространственные паттерны долговременной потенциации в срезах гиппокампа крыс.J Physiol. 2006. 576 (Pt 2): 427–43.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Айткен П.Г., Фаюк Д., Сомьен Г.Г., Тернер Д.А. Использование собственных оптических сигналов для отслеживания физиологических изменений в срезах ткани головного мозга. Методы. 1999; 18: 91–103.
CAS PubMed Google Scholar
Пуратиан Н., Каннестра А.Ф., Мартин Н.А., Тога А.В. Интраоперационная визуализация оптического внутреннего сигнала: клинический инструмент для функционального картирования мозга.Нейрохирург Фокус. 2002; 13, e1.
PubMed Google Scholar
Пракаш Н., Улеманн Ф., Шет С.А., Букхаймер С., Мартин Н., Тога А.В. Современные тенденции в интраоперационной оптической визуализации для функционального картирования мозга и очерчивания поражений коры языка. Нейроизображение. 2009; 47 Приложение 2: T116–26.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Эндрю Р.Д., Джарвис С.Р., Обейдат А.С.Потенциальные источники собственных оптических сигналов, отображаемых в живых срезах мозга. Методы. 1999; 18: 185–96.
CAS PubMed Google Scholar
Араке А., Карминьото Г., Хейдон П. Г., Олиет Ш. Р., Робитайл Р., Вольтерра А. Передатчики глиотрансформации путешествуют во времени и пространстве. Нейрон. 2014; 81: 728–39.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Агульхон С., Сан М-И, Мерфи Т., Майерс Т., Лодердейл К., Фиакко Т.А.Передача сигналов кальция и глиотрансмиссия в нормальных и реактивных астроцитах Front Pharmacol. 2012; 3: 139.
Google Scholar
Бен Ачур С., Паскуаль О. Связь астроцитов и нейронов: функциональные последствия. Neurochem Res. 2012; 37: 2464–73.
CAS PubMed Google Scholar
Гучек А., Варджан Н., Зорец Р. Экзоцитоз в астроцитах: высвобождение медиатора и регуляция мембранного сигнала.Neurochem Res. 2012; 37: 2351–63.
PubMed Google Scholar
Сантелло М., Кали К., Беззи П. Глиотрансмиссия и трехсторонний синапс. Adv Exp Med Biol. 2012; 970: 307–31.
CAS PubMed Google Scholar
Зореч Р., Арак А., Карминьото Г., Хейдон П.Г., Верхратский А., Парпура В. Астроглиальная возбудимость и глиотрансмиссия: оценка Ca 2+ как сигнального пути.ASN Neuro. 2012; 4.
Hill MRH, Гринфилд С.А. Характеристика раннего ответа кортикальной популяции на таламокортикальный вход in vitro. Front Neurosci. 2013; 7 (январь): 273.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Кун Б., Денк В., Бруно Р.М. Двухфотонное изображение чувствительного к напряжению красителя in vivo выявляет нисходящий контроль корковых слоев 1 и 2 во время бодрствования. Proc Natl Acad Sci U S A.2008; 105: 7588–93.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Broicher T., Bidmon H-J, Kamuf B., Coulon P, Gorji A, Pape H-C, et al. Таламическая афферентная активация надгранулярных слоев слуховой коры in vitro: исследование с красителем, чувствительным к напряжению. Неврология. 2010; 165: 371–85.
CAS PubMed Google Scholar
Ayzenshtat I, Meirovithz E, Edelman H, Werner-Reiss U, Bienenstock E, Abeles M, et al.Точные пространственно-временные паттерны среди зрительных областей коры и их связь с обработкой зрительных стимулов. J Neurosci. 2010. 30: 11232–45.
CAS PubMed Google Scholar
McQuiston a R. Холинергическая модуляция возбуждающего синаптического входа интеграции в CA1 гиппокампа. J Physio. 2010; 588 ((Pt 19): 3727–42.
Google Scholar
Shi Y, Ikrar T, Olivas ND, Xu X.Двунаправленная глобальная спонтанная сетевая активность предшествует канонической однонаправленной организации контуров в развивающемся гиппокампе. J Comp Neurol. 2014; 522: 2191–208.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Andersen P, Bliss TV, Lomo T, Olsen LI, Skrede KK. Ламеллярная организация нервных путей гиппокампа. Acta Physiol Scand. 1971; 76: 4A – 5.
Google Scholar
Barbarosie M, Avoli M. CA3-управляемая гиппокампально-энторинальная петля скорее контролирует, чем поддерживает лимбические припадки in vitro. J Neurosci. 1997; 17: 9308–14.
CAS PubMed Google Scholar
Шульц К., Энгельгардт М. Анатомия образования гиппокампа. Front Neurol Neurosci. 2014; 34: 6–17.
PubMed Google Scholar
Андерсен П., Моррис Р., Амарал Д., Блисс Т., О’Киф Дж. (Редакторы): Нейроанатомия гиппокампа.В Книге Гиппокампа. Нью-Йорк: издательство Оксфордского университета; 2007: 37–110.
McBain CJ, Traynelis SF, Dingledine R. Региональные вариации внеклеточного пространства в гиппокампе. Наука. 1990; 249: 674–7.
CAS PubMed Google Scholar
Тони GM. Регулирование объема нейрональных клеток: от активации до торможения и до дегенерации. J Physiol. 2010. 588 (Pt 18): 3347–8.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Хилл, Британская Колумбия, Шуберт Э.Д., Ноукс М.А., Михельсон Р.П. Измерение лазерным интерферометром изменений диаметра аксонов раков одновременно с потенциалом действия. Наука. 1977; 196: 426–8.
CAS PubMed Google Scholar
Поля RD: передача сигналов отека нейронов. Sci Signal 2011, 4: tr1.
Ким Г.Х., Костерин П., Обейд А.Л., Зальцберг Б.М. Механический импульс сопровождает потенциал действия в нервных окончаниях млекопитающих.Биофиз Дж. 2007; 92: 3122–9.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Эндрю Р.Д., Лаброн М.В., Бёнке С.Е., Карндафф Л., Киров С.А. Физиологические доказательства того, что пирамидные нейроны лишены функциональных водных каналов. Cereb Cortex. 2007; 17: 787–802.
PubMed Google Scholar
Hoomann T, Jahnke N, Horner A, Keller S, Pohl P. Закрытие затвора фильтра препятствует переносу ионов, но не воды через калиевые каналы.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013; 110: 10842–7.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Nyitrai G, Kékesi KA, Juhász G. Внеклеточный уровень ГАМК и Glu: измерения микродиализа-ВЭЖХ in vivo. Curr Top Med Chem. 2006; 6: 935–40.
CAS PubMed Google Scholar
Massieu L, Morales-Villagrán A, Tapia R. Накопление внеклеточного глутамата путем ингибирования его поглощения недостаточно для индукции повреждения нейронов: исследование микродиализа in vivo.J Neurochem. 1995; 64: 2262–72.
CAS PubMed Google Scholar
Zhang M, Li W-B, Liu Y-X, Liang C-J, Liu L-Z, Cui X, et al. Высокая экспрессия GLT-1 в субполях CA3 гиппокампа и зубчатой извилине способствует присущей им устойчивости к ишемии у крыс. Neurochem Int. 2011; 59: 1019–28.
CAS PubMed Google Scholar
Deitmer JW, Rose CR.Ионные изменения и передача сигналов в перисинаптической глии. Brain Res Rev.2010; 63: 113–29.
CAS PubMed Google Scholar
Hertz L, Xu J, Song D, Yan E, Gu L, Peng L. Астроцитарное и нейронное накопление повышенного внеклеточного K + с потоком 2/3 K + / Na + соотношение-последствия для энергетического обмена, осмолярности и высшей функции мозга. Front Comput Neurosci. 2013; 7 (август): 114.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Балена Т, Актон Б.А., Коваль Д., Вудин М.А. Внеклеточный калий регулирует обратный потенциал хлоридов в культивируемых нейронах гиппокампа. Brain Res. 2008; 1205: 12–20.
CAS PubMed Google Scholar
Кале К.Т., Стейли К.Дж., Нахед Б.В., Гамба Г., Хеберт С.К., Лифтон Р.П. и др. Роль котранспортеров хлорида катионов в неврологических заболеваниях. Nat Clin Pract Neurol. 2008; 4: 490–503.
CAS PubMed Google Scholar
Корн С.Дж., Джаккино Дж.Л., Чемберлин Н.Л., Дингледин Р. Эпилептиформная всплеск-активность, индуцированная калием в гиппокампе, и ее регулирование с помощью ГАМК-опосредованного ингибирования. J Neurophysiol. 1987. 57: 325–40.
CAS PubMed Google Scholar
Трайнелис С.Ф., Дингледин Р. Спонтанные электрографические припадки, вызванные калием, в срезе гиппокампа крысы. J Neurophysiol. 1988. 59: 259–76.
CAS PubMed Google Scholar
Гуляс А.И., Сик А., Пейн Дж. А., Кайла К., Фройнд Т.Ф. Котранспортер KCl, KCC2, высоко экспрессируется вблизи возбуждающих синапсов в гиппокампе крысы. Eur J Neurosci. 2001; 13: 2205–17.
PubMed Google Scholar
Macvicar BA, Feighan D, Brown A, Ransom B. Внутренние оптические сигналы в зрительном нерве крысы: роль захвата K + через NKCC1 и набухание астроцитов. Глия. 2002; 37: 114–23.
PubMed Google Scholar
Kimelberg HK, Frangakis MV. Чувствительный к фуросемиду и буметаниду ионный транспорт и контроль объема в первичных культурах астроцитов из головного мозга крысы. Brain Res. 1985; 361: 125–34.
CAS PubMed Google Scholar
Джала В.И., Талос Д.М., Сдрулла Д.А., Брамбак А.С., Мэтьюз Г.К., Бенке Т.А. и др. Транспортер NKCC1 способствует припадкам в развивающемся головном мозге. Nat Med. 2005; 11: 1205–13.
CAS PubMed Google Scholar
Delpire E, Baranczak A, Waterson AG, Kim K, Kett N, Morrison RD и др. Дальнейшая оптимизация котранспортера K-Cl антагониста KCC2 ML077: разработка высокоселективного и более эффективного зонда in vitro. Bioorganic Med Chem Lett. 2012; 22: 4532–5.
CAS Google Scholar
Ваффорд К.А., Томпсон С.А., Томас Д., Сикела Дж., Уилкокс А.С., Уайтинг П.Дж. Функциональная характеристика человеческих рецепторов гамма-аминомасляной кислоты А, содержащих субъединицу альфа 4.Mol Pharmacol. 1996; 50: 670–8.
CAS PubMed Google Scholar
Halligan RD, Shelat H, Kahn AM. Na + -независимый обмен Cl — -HCO3 — в сарколеммальных пузырьках из гладких мышц сосудов. Am J Physiol. 1991; 260 (2 Pt 1): C347–54.
CAS PubMed Google Scholar
Vilas GL, Johnson DE, Freund P, Casey JR.Характеристика ассоциированного с эпилепсией варианта человеческого обменника Cl — / HCO3 — AE3. Am J Physiol Cell Physiol. 2009; 297: C526–36.
CAS PubMed Google Scholar
Hentschke M, Wiemann M, Hentschke S, Kurth I, Hermans-Borgmeyer I, Seidenbecher T, et al. Мыши с целевым нарушением работы обменника Cl — / HCO3 — AE3 демонстрируют пониженный порог захвата. Mol Cell Biol.2006; 26: 182–91.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Holthoff K, Witte OW. Внутренние оптические сигналы в срезах неокортекса крысы, измеренные с помощью ближней инфракрасной микроскопии в темном поле, выявляют изменения во внеклеточном пространстве. J Neurosci. 1996; 16: 2740–9.
CAS PubMed Google Scholar
Коннерт А., Обейд А.Л., Зальцберг Б.М. Оптическая регистрация электрической активности параллельных волокон и других типов клеток в срезах мозжечка конькового хода in vitro.J Physiol. 1987; 393: 681–702.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Larsen BR, Assentoft M, Cotrina ML, Hua SZ, Nedergaard M, Kaila K, Voipio J, MacAulay N. Вклад Na + / K + -ATPase, NKCC1 и K ir4.1 в гиппокамп K + , клиренс и объемные ответы. Глия. 2014; 62: 608–22.
Джукич Б., Каспер КБ, Филпот Б.Д., Чин Л.С., Маккарти К.Д.Условный нокаут K ir4.1 приводит к деполяризации глиальной мембраны, ингибированию захвата калия и глутамата и усилению кратковременной синаптической потенциации. J Neurosci. 2007. 27: 11354–65.
CAS PubMed Google Scholar
Macaulay N, Zeuthen T. Glial K + клиренс и набухание клеток: ключевые роли для котранспортеров и насосов. Neurochem Res. 2012; 37: 2299–309.
CAS PubMed Google Scholar
Walz W, Shargool M, Hertz L. Индуцированное барием ингибирование механизмов транспорта K + в корковых астроцитах — его возможный вклад в большой вызванный Ba2 + внеклеточный сигнал K + в головном мозге. Неврология. 1984; 13: 945–9.
CAS PubMed Google Scholar
Киви А., Леманн Т.Н., Ковач Р., Эйлерс А., Яух Р., Минке Х.Д. и др. Влияние бария на индуцированное стимулом повышение [K + ] o в эпилептической несклеротической и склеротической области СА1 гиппокампа человека.Eur J Neurosci. 2000; 12: 2039–48.
CAS PubMed Google Scholar
Андреасен М., Сков Дж., Недергаард С. Внутренне выпрямляющие каналы K + (Kir) противодействуют иктало-подобной эпилептиформной активности в области СА1 гиппокампа крысы. Гиппокамп. 2007; 17: 1037–48.
CAS PubMed Google Scholar
Day M, Carr DB, Ulrich S, Ilijic E, Tkatch T, Surmeier DJ.Дендритная возбудимость пирамидных нейронов лобной коры головного мозга мышей формируется взаимодействием между HCN, K ir2 и K утечка каналов. J Neurosci. 2005; 25: 8776–87.
CAS PubMed Google Scholar
Betourne A, Bertholet AM, Labroue E, Halley H, Sun HS, Lorsignol A, et al. Вовлечение каналов CA3 K ATP гиппокампа в контекстную память. Нейрофармакология. 2009; 56: 615–25.
CAS PubMed Google Scholar
Гибор Г., Якубович Д., Перец А., Аттали Б. Внешний барий влияет на закрытие калиевых каналов KCNQ1 и создает блок пор через два отдельных участка. J Gen Physiol. 2004. 124: 83–102.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Chever O, Djukic B, McCarthy KD, Amzica F. Влияние канала Kir4.1 на избыточный клиренс калия: исследование in vivo на анестезированных мышах с глиальным условным нокаутом Kir4.1.J Neurosci. 2010; 30: 15769–77.
CAS PubMed Google Scholar
Ван Дж., Велотта Дж. Б., Макдонау А.А., Фарли Р.А. Все изоформы альфа-субъединиц Na + -K + -АТФазы человека обладают сходным сродством к сердечным гликозидам. Am J Physiol Cell Physiol. 2001; 281: C1336–43.
CAS PubMed Google Scholar
Loreaux EL, Kaul B, Lorenz JN, Lingrel JB.Уабаин-чувствительная альфа-1 Na, K-АТФаза усиливает натрийуретический ответ на солевую нагрузку. J Am Soc Nephrol. 2008; 19: 1947–54.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Price EM, Lingrel JB. Взаимоотношения структура-функция в альфа-субъединице Na, K-АТФазы: сайт-направленный мутагенез глутамина-111 до аргинина и аспарагина-122 до аспарагиновой кислоты генерирует устойчивый к уабаину фермент. Биохимия. 1988. 27: 8400–8.
CAS PubMed Google Scholar
O’Brien WJ, Lingrel JB, Wallick ET. Кинетика связывания уабаина изоформ альфа-два и альфа-три крысиного калия аденозинтрифосфата. Arch Biochem Biophys. 1994; 310: 32–9.
PubMed Google Scholar
Бланко Дж., Се З. Дж., Мерсер РВ. Функциональная экспрессия изоформ альфа 2 и альфа 3 Na, K-АТФазы в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1993; 90: 1824–8.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Hassel B, Paulsen R, Johnsen A, Fonnum F. Селективное ингибирование метаболизма глиальных клеток in vivo фторцитратом. Brain Res. 1992; 576: 120–4.
CAS PubMed Google Scholar
Swanson RA, Graham SH. Влияние фторцитрата и фторацетата на метаболизм астроцитов in vitro.Brain Res. 1994; 664: 94–100.
CAS PubMed Google Scholar
Гринвальд А., Хильдесхайм Р., Фарбер И.С., Англистер Л. Улучшенные флуоресцентные зонды для измерения быстрых изменений мембранного потенциала. Biophys J. 1982; 39: 301–8.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Buchheim K, Wessel O, Siegmund H, Schuchmann S, Meierkord H.Процессы и компоненты, участвующие в генерации собственного оптического сигнала, изменяются in vitro. Eur J Neurosci. 2005; 22: 125–32.
PubMed Google Scholar
Holthoff K, Witte OW. Внутренние оптические сигналы in vitro: инструмент для измерения изменений во внеклеточном пространстве с двумерным разрешением. Brain Res Bull. 1998. 47: 649–55.
CAS PubMed Google Scholar
Cerne R, Haglund MM. Электрофизиологические коррелируют с собственным оптическим сигналом в неокортикальном срезе крысы. Neurosci Lett. 2002; 317: 147–50.
CAS PubMed Google Scholar
Коултер Д.А., Ид Т. Астроцитарная регуляция гомеостаза глутамата при эпилепсии. Глия. 2012; 60: 1215–26.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Ransom BR, Ransom CB.Астроциты: разносторонние звезды центральной нервной системы. Методы Мол биол. 2012; 814: 3–7.
CAS PubMed Google Scholar
Bergles DE, Jahr CE. Вклад глии в захват глутамата в коллатерально-комиссуральных синапсах Шаффера в гиппокампе. J Neurosci. 1998; 18: 7709–16.
CAS PubMed Google Scholar
Gurden H, Uchida N, Mainen ZF.Сенсорные внутренние оптические сигналы в обонятельной луковице связаны с высвобождением и поглощением глутамата. Нейрон. 2006; 52: 335–45.
CAS PubMed Google Scholar
Хуанг YH, Sinha SR, Tanaka K, Rothstein JD, Bergles DE. Переносчики глутамата астроцитов регулируют опосредованное метаботропным рецептором глутамата возбуждение интернейронов гиппокампа. J Neurosci. 2004; 24: 4551–9.
CAS PubMed Google Scholar
Робертс RC, Roche JK, McCullumsmith RE. Локализация возбуждающих переносчиков аминокислот EAAT1 и EAAT2 в посмертной коре головного мозга человека: световое и электронно-микроскопическое исследование. Неврология. 2014; 277: 522–40.
CAS PubMed Google Scholar
Лере К.П., Данболт, Северная Каролина. Число молекул подтипа переносчика глутамата в глутаматергических синапсах: химическая и стереологическая количественная оценка в мозге молодых взрослых крыс.J Neurosci. 1998; 18: 8751–7.
CAS PubMed Google Scholar
Danbolt NC. Поглощение глутамата. Prog Neurobiol. 2001; 65: 1–105.
CAS PubMed Google Scholar
Bjørnsen LP, Eid T, Holmseth S, Danbolt NC, Spencer DD, de Lanerolle NC. Изменения в глиальных транспортерах глутамата в эпилептогенном гиппокампе человека: неадекватное объяснение высокого уровня внеклеточного глутамата во время судорог.Neurobiol Dis. 2007; 25: 319–30.
PubMed Google Scholar
Benediktsson AM, Marrs GS, Tu JC, Worley PF, Rothstein JD, Bergles DE, et al. Активность нейронов регулирует динамику переносчиков глутамата в развивающихся астроцитах. Глия. 2012; 60: 175–88.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Чен В., Махадомронгкул В., Бергер Ю.В., Бассан М., ДеСильва Т., Танака К. и др.Переносчик глутамата GLT1a экспрессируется в терминалах возбуждающих аксонов зрелых нейронов гиппокампа. J Neurosci. 2004. 24: 1136–48.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Фернесс Д. Н., Дехнес Ю., Ахтар А. К., Росси Д. Д., Хаманн М., Грутле Н. Дж. И др. Количественная оценка поглощения глутамата синаптическими окончаниями и астроцитами гиппокампа: новое понимание нейрональной роли возбуждающего переносчика аминокислот 2 (EAAT2).Неврология. 2008. 157: 80–94.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Schmitt A, Asan E, Lesch K-P, Kugler P. Сплайсинговый вариант транспортера глутамата GLT1 / EAAT2, экспрессируемый в нейронах: клонирование и локализация в нервной системе крыс. Неврология. 2002; 109: 45–61.
CAS PubMed Google Scholar
Цингунис А.В., Вадиче Дж.Переносчики глутамата: ограничение беглого возбуждения за счет формирования синаптической передачи. Nat Rev Neurosci. 2007; 8: 935–47.
CAS PubMed Google Scholar
Чжоу Ю., Ван Х, Цзингунис А.В., Данболт, Северная Каролина, Ларссон, HP. Переносчики глутамата EAAT2 (GLT-1; slc1a2), восстановленные в липосомах, выступают против того, чтобы гетерообмен был значительно быстрее, чем чистое поглощение. J Neurosci. 2014; 34: 13472–85.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Bellesi M, Melone M, Gubbini A, Battistacci S, Conti F. Повышение регуляции GLT-1 нарушает предымпульсное торможение рефлекса испуга у взрослых крыс. Глия. 2009; 57: 703–13.
PubMed Google Scholar
Amzica F, Steriade M. Нейрональные и глиальные мембранные потенциалы во время сна и пароксизмальные колебания в неокортексе. J Neurosci. 2000; 20: 6648–65.
CAS PubMed Google Scholar
Dallérac G, Chever O, Rouach N. Как астроциты формируют синаптическую передачу? Выводы из электрофизиологии. Front Cell Neurosci. 2013; 7 (октябрь): 159.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Diamond JS. Получение динамики клиренса глутамата из транспортных потоков в астроцитах гиппокампа CA1: поглощение медиатора ускоряется во время развития. J Neurosci. 2005; 25: 2906–16.
CAS PubMed Google Scholar
Лере К.П., Леви Л.М., Оттерсен О.П., Сторм-Матисен Дж., Данболт, Северная Каролина. Дифференциальная экспрессия двух глиальных транспортеров глутамата в головном мозге крысы: количественные и иммуноцитохимические наблюдения. J Neurosci. 1995; 15 (3 Pt 1): 1835–53.
CAS PubMed Google Scholar
Hama K, Arii T, Katayama E, Marton M, Ellisman MH. Трехмерный морфометрический анализ астроцитарных процессов с помощью высоковольтной электронной микроскопии толстых препаратов Гольджи.J Neurocytol. 2004. 33: 277–85.
CAS PubMed Google Scholar
Петерка Д.С., Такахаши Х., Юсте Р. Отображение напряжения в нейронах. Нейрон. 2011; 69: 9–21.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Чжоу М., Сюй Г., Се М., Чжан Х, школьный врач общей практики, Ма Л. и др. TWIK-1 и TREK-1 представляют собой калиевые каналы, вносящие значительный вклад в пассивную проводимость астроцитов в срезах гиппокампа крыс.J Neurosci. 2009. 29: 8551–64.
CAS PubMed Google Scholar
Верхратский А., Недергаард М., Герц Л. Почему астроциты важны? Neurochem Res . 2014.
Google Scholar
Héja L, Nyitrai G, Kékesi O, Dobolyi A, Szabó P, Fiáth R, et al. Астроциты преобразуют сетевое возбуждение в тоническое торможение нейронов. BMC Biol. 2012; 10:26.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Хея Л., Барабас П., Нитрай Г., Кекеси К.А., Ластоци Б., Токе О. и др. Поглощение глутамата запускает опосредованное транспортером высвобождение ГАМК из астроцитов. PLoS One. 2009; 4, e7153.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Beavis AD, Davatol-Hag H. Анионный канал внутренней мембраны митохондрий ингибируется DIDS.J Bioenerg Biomembr. 1996; 28: 207–14.
CAS PubMed Google Scholar
Wang HS, Dixon JE, McKinnon D. Неожиданные и дифференциальные эффекты блокаторов каналов Cl — на K v4.3 и K v4.2 K + каналов. значение для изучения тока от I до 2 . Circ Res. 1997. 81: 711–8.
CAS PubMed Google Scholar
Pusch M, Zifarelli G, Murgia AR, Picollo A, Babini E. Канал или транспортер? сага о CLC продолжается. Exp Physiol. 2006; 91: 149–52.
CAS PubMed Google Scholar
Морита Х, Хонда А, Иноуэ Р., Ито Й, Абе К., Нельсон М. Т. и др. Вызванная растяжением мембрана активация TRPM4-подобного неселективного катионного канала в миоцитах артерий головного мозга. J Pharmacol Sci. 2007; 103: 417–26.
CAS PubMed Google Scholar
Исида Т., Такидзава Ю., Кайнума Т., Иноуэ Дж., Микава Т., Шибата Т. и др. DIDS, химическое соединение, которое ингибирует опосредованное RAD51 гомологичное спаривание и обмен цепей. Nucleic Acids Res. 2009; 37: 3367–76.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Romero MF, Boron WF. Электрогенные котранспортеры Na + / HCO3 — : клонирование и физиология. Annu Rev Physiol. 1999; 61: 699–723.
CAS PubMed Google Scholar
Лай З.Ф., Лю Дж., Ниши К. Влияние производных стильбена SITS и DIDS на развитие внутриклеточного ацидоза во время ишемии в изолированной желудочковой папиллярной мышце морской свинки in vitro. Jpn J Pharmacol. 1996; 72: 161–74.
CAS PubMed Google Scholar
Гибсон Х. Э., Эдвардс Дж. Г., Пейдж Р. С., Ван Хук М. Дж., Кауэр Дж. А.. Каналы TRPV1 опосредуют длительную депрессию синапсов на интернейронах гиппокампа. Нейрон. 2008; 57: 746–59.
CAS PubMed Central PubMed Google Scholar
Кирищук С., Парпура В., Верхратский А. Динамика натрия: еще один ключ к астроглиальной возбудимости? Trends Neurosci. 2012; 35: 497–506.
CAS PubMed Google Scholar
Верхратский А., Штайнхойзер С. Ионные каналы в глиальных клетках. Brain Res Brain Res Rev.2000; 32: 380–412.
CAS PubMed Google Scholar
Kimelberg HK, Macvicar BA, Sontheimer H. Анионные каналы в астроцитах: биофизика, фармакология и функции. Глия. 2006. 54: 747–57.
PubMed Central PubMed Google Scholar
Lasztóczi B, Antal K, Nyikos L, Emri Z, Kardos J. Высокочастотный синаптический вход способствует инициированию приступа в модели эпилепсии с низким [Mg 2+ ]. Eur J Neurosci. 2004; 19: 1361–72.
PubMed Google Scholar
Чанг П.Й., Джексон МБ. Интерпретация и оптимизация сигналов поглощения и флуоресценции чувствительных к напряжению красителей. J Membr Biol. 2003. 196: 105–16.
CAS PubMed Google Scholar
Momose-Sato Y, Sato K, Arai Y, Yazawa I., Mochida H, Kamino K. Оценка чувствительных к напряжению красителей для долгосрочной регистрации нервной активности в гиппокампе. J Membr Biol. 1999. 172: 145–57.
CAS PubMed Google Scholar
Андерсон WW, Коллингридж ГЛ. Программа LTP: программа сбора данных для онлайн-анализа долгосрочной потенциации и других синаптических событий. J Neurosci Methods. 2001; 108: 71–83.
CAS PubMed Google Scholar
Кливленд WS. Надежная локально взвешенная регрессия и сглаживающие диаграммы рассеяния. J Am Stat Assoc. 1979; 74: 829.
Google Scholar
Трехмерная архитектура пресинаптического терминала Cytomatrix
Аннотация
Пресинаптические терминалы специализируются на обеспечении быстрого слияния синаптических пузырьков (SV) после притока кальция.Регулируемый оборот SV, вероятно, является результатом высокоорганизованной цитоматрицы. Как эта цитоматрикс связывает SV, поддерживает их рядом с активными зонами (AZ) выпуска и организует пристыкованные SV в местах выпуска, не совсем понятно.
Для анализа трехмерной (3D) архитектуры пресинаптической цитоматрицы была проведена электронная томография пресинаптических окончаний, контактирующих с шипами, в stratum radiatum области CA1 гиппокампа крысы. Чтобы сохранить цитоматрикс, срезы гиппокампа были иммобилизованы с использованием замораживания под высоким давлением с последующим криозамещением и заделкой.SV окружены густой сетью нитей. Данная везикула связана с ~ 1.5 соседними. SV на периферии этой сети также связаны с плазматической мембраной более длинными нитями. Больше таких нитей можно найти в зоне АЗ. В зоне АЗ пристыкованные КА группируются по пресинаптической плотности. Нити с соседними SV выходят из этих плотностей. Локализация иммунного золота показала, что синапсин расположен в пресинаптическом бутоне, тогда как фагот и CAST (ERC2) находятся в фокусных точках рядом с AZ.У мышей с тройным нокаутом по синапсину количество SV снижается на 63%, но размер бутонов уменьшается только на 18%, а среднее расстояние SV до AZ остается неизменным.
Этот трехмерный анализ показывает морфологические ограничения, наложенные пресинаптическим молекулярным каркасом. SV тесно связаны между собой в аксональном бутоне, и эта сеть предпочтительно связана с AZ.
Введение
После притока кальция синаптические везикулы (SV) сливаются с пресинаптической плазматической мембраной, высвобождая свой нейромедиатор в активной зоне (AZ) (Del Castillo and Katz, 1954; Heuser and Reese, 1981; Südhof, 2004; Jahn and Scheller). , 2006).Некоторые SV должны быть готовы к слиянию для быстрого высвобождения нейромедиатора (Schneggenburger and Neher, 2005). Эти «примированные» SV, вероятно, будут состыкованы (т.е. находятся в контакте с плазматической мембраной AZ) (Harris and Sultan, 1995; Schikorski and Stevens, 1997, 2001). В бутоне поддерживается резервный пул SV (Rizzoli and Betz, 2005).
Пресинаптические терминалы должны быть высокоорганизованными для регулируемого трафика SV. Исследования с использованием окрашивания фосфорновольфрамовой кислотой показали регулярно расположенные плотные выступы в зоне АЗ с пристыкованными SV, расположенными между ними (Gray, 1963; Pfenninger et al., 1972; Триллер и Корн, 1985; Peters et al., 1991; Филлипс и др., 2001; Чжай и Беллен, 2004). Однако альдегидные фиксаторы, использованные в этих исследованиях, объединяют нити (Gulley and Reese, 1981; Tatsuoka and Reese, 1989; Gotow et al., 1991). Быстрое замораживание без альдегидов позволило наблюдать короткие волокна, соединяющие соседние SV, и более длинные волокна, выступающие из мембраны AZ (Landis et al., 1988; Hirokawa et al., 1989; Tatsuoka and Reese, 1989; Gotow et al., 1991). Короткие мостики могут быть синапсинами, связывающими SV вместе или с цитоскелетом (Landis et al., 1988; Hirokawa et al., 1989; Takei et al., 1995). Морфологические исследования нокаута синапсина (KO) привели к мнению, что синапсины способствуют поддержанию SV на расстоянии от AZ и форме бутона (Takei et al., 1995; Gitler et al., 2004) . Однако пространственная организация и плотность волокон, связывающих SV вместе и поддерживающих их в зоне AZ, не выяснены.
Чтобы определить трехмерную (3D) архитектуру пресинаптической цитоматрицы, мы проанализировали распределение SV и филаментов с помощью электронной томографии.Разрешение значительно улучшается при использовании электронной томографии по сравнению со стандартной электронной микроскопией (Koster et al., 1997; Harlow et al., 2001; Marco et al., 2004; Lucic et al., 2005). Виртуальные серийные срезы высокого (4 нм) разрешения можно получить с толстого объекта. Ткань иммобилизовали с помощью замораживания под высоким давлением (HPF; p > 2100 бар) с последующим криозамещением и заливкой. HPF снижает образование кристаллов льда (Moor, 1987; Dubochet, 1995; Wilson et al., 1998; Zuber et al., 2005). HPF без альдегидов предотвращает коллапс пресинаптических окончаний и сохраняет филаменты (Rostaing et al., 2006). Мы проанализировали синапсы позвоночника в лучевом слое CA1 из гиппокампа грызунов. Наше исследование показало, что сеть нитей контактирует с КА. Другие нити, связывающие эту ткань с плазматической мембраной, сосредоточены в зоне AZ. В зоне АЗ пристыкованные КА группируются вокруг пресинаптического плотного материала. В согласии с предыдущими исследованиями мы обнаружили, что 63% SVs теряются у мышей с тройным нокаутом синапсина 1–3 (TKO).Однако уменьшение размера пресинаптических окончаний является слабым, и среднее расстояние SV до АЗ остается неизменным, что позволяет предположить, что лежащая в основе цитоматрикс не модифицируется.
Материалы и методы
HPF.
Использовали восемь 21-дневных самцов крыс Sprague Dawley (Жанвье, Ле-Женест-Сен-Айл, Франция). Кроме того, три постнатальных дня 20 (P20) синапсин 1-3 TKO (Gitler et al., 2004) и трех мышей P20 C57BL / 6 (Janvier). Протокол был таким, как описано ранее (Rostaing et al., 2004, 2006). Вкратце, грызуны получили передозировку пентобарбитала натрия (150–200 мг / кг). Их обезглавили, а их мозг быстро перенесли в ледяную среду для препарирования без кальция (Fiala et al., 2003). Гиппокамп иссекали, и срезы размером 400 мкм вырезали перпендикулярно к перегородке с помощью измельчителя тканей McIllwain (Mickle Laboratory, Surrey, UK).Участок CA1 одного среза был обрезан, чтобы поместиться в алюминиевый сэндвич-носитель, и заморожен в аппарате Bal-Tec HPM 010 HPF, с учетом интервала ~ 7 мин между удалением мозга и замораживанием. Срезы четырех крыс и шести мышей использовали для морфологического анализа, тогда как срезы трех других крыс использовали для иммуноцитохимии. Срез гиппокампа восьмой крысы инкубировали в течение 5 минут в среде для рассечения с добавлением 20% декстрана и 5% сахарозы перед замораживанием (Zuber et al., 2005) и используется для морфологического анализа. После замораживания образец быстро переносили в жидкий азот для хранения.
Криозамещение и заливка.
Криозамещение и внедрение выполняли в аппарате Reichert AFS (Leica, Вена, Австрия), как описано ранее (Rostaing et al., 2006). Для морфологического анализа и иммуноцитохимического анализа использовались два отдельных протокола. Вкратце, для морфологического анализа криозамещение проводили в ацетоне с 0.1% дубильная кислота при -90 ° C в течение 4 дней, а затем ацетон с 2% осмия в течение последних 7 часов. Срезы нагревали (5 ° C / час) до -20 ° C и инкубировали еще 16 часов перед нагреванием (10 ° C / час) до 4 ° C. При 4 ° C срезы промывали ацетоном и нагревали до комнатной температуры. Затем они были внедрены в аралдит. Для иммуноцитохимии криозамещение проводили в метаноле с 1,5% уранилацетатом при -90 ° C в течение 4 дней. Срезы нагревали (4 ° C / ч) до -45 ° C и заливали в Lowicryl (набор HM20, каталог № 15924; Polysciences, Warrington, PA).
Секционирование.
Ультратонкие (70 нм, бледно-желтые) срезы были вырезаны с использованием Leica Ultracut UCT. Срезы для иммуноцитохимии собирали на покрытых формваром никелевых сетках 400 меш, тогда как срезы для морфологического анализа собирали на медных сетках 400 меш. Для томографического анализа срезы толщиной 200 нм собирали на медных сетках 400 меш.
Иммуноцитохимия.
Иммуноцитохимия выполнялась, как описано ранее (Rostaing et al., 2006). Вкратце, срезы инкубировали в течение 30 мин в блокирующем растворе (905,002; Aurion, Wageningen, Нидерланды). После промывок в инкубационном буфере, 0,2% BSA-c (900.099; Aurion) в PBS, срезы инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре в инкубационном буфере, содержащем антитела против синаптофизина (1:10, A0010; DakoCytomation, Glostrup, Дания), синапсин (1: 100, антитело 1543; Chemicon, Temecula, CA), Bassoon [1: 100, антитело sap7f; антитело, описанное Tom Dieck et al.(1998)] и CAST [цитоматрикс связанного с AZ структурного белка; 1:10; антитело, описанное Ohtsuka et al. (2002), Hagiwara et al. (2005) и Deguchi-Tawarada et al. (2006)]. После промываний в инкубационном буфере срезы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в конъюгированных с золотом вторичных антикроличьих антителах и мышиных IgG (1:50; British Biocell International, Кардифф, Великобритания). Срезы промывали, фиксировали 1% глутаровым альдегидом (TAAB, Poole, UK) в PBS в течение 5 мин и промывали перед сушкой на воздухе.
Контрастное окрашивание и исследование срезов.
Для морфологического анализа срезы окрашивали инкубацией с 2% уранилацетатом в дистиллированной воде (dH 2 O) в течение 5 минут, а затем с цитратом свинца (0,08 мкм нитрата свинца и 0,12 мкм цитрата натрия в CO 2 — свободный dH 2 O) в течение 5 мин. После иммуноцитохимии срезы контрастировали путем инкубации с 5% уранилацетатом в 70% метаноле в течение 10 минут с последующей инкубацией с цитратом свинца в течение 3 минут.Срезы наблюдали в Philips TECNAI 12 (FEI, Эйндховен, Нидерланды).
Выборка синапсов.
Шипованные синапсы были проанализированы в stratum radiatum, на расстоянии 150–200 мкм от stratum pyramidale. Мы отличали синапсы позвоночника от стержневых синапсов на основании небольшого размера постсинаптического профиля и отсутствия митохондрий и микротрубочек в постсинаптическом компартменте (Peters et al., 1991). Как описано ранее, рассечение ткани приводит к изменению ультраструктуры в пределах 100 мкм от места разреза (Rostaing et al., 2006). Кроме того, ретикуляция ядер, вероятно, связанная с образованием мелких кристаллов льда, начинается на ∼80 мкм от границы срезов и увеличивается к центру. В центре ломтиков образовались крупные кристаллы льда. Мы выполнили анализ на расстоянии 60–100 мкм от границы срезов, но мы подтвердили, что описанная здесь структура пресинаптических окончаний также наблюдалась (1) в сердцевине срезов, что указывает на то, что она не возникла в результате повреждения ткани, и (2) после криопротекции декстраном и сахарозой, что означает, что это не было вызвано образованием кристаллов льда.
Томография.
Для томографического анализа толстые (200 или 300 нм) срезы инкубировали в течение 30 мин с каждой стороны с неразбавленными частицами золота 10 нм, конъюгированными со вторичными антикроличьими антителами (British Biocell International), и окрашивали путем инкубации с 2% уранилацетатом в dH. 2 O в течение 10 мин, затем цитрат свинца в течение 10 мин. Срезы переносили в электронный микроскоп LEO 912.Электронный микроскоп работал при 120 кВ с использованием встроенного в колонку энергетического фильтра омега-типа. Восемнадцать синапсов были записаны с помощью камеры Proscan CCD с медленным сканированием 1024 × 1024 при увеличении 10000 × или 20000 × (что соответствует размеру пикселя 1,7 и 0,87 нм, соответственно). Наклонные серии с нулевыми потерями (примерно от -55 ° до + 55 ° с шагом 1 °) были получены с использованием программы ESIvision (версия 3.0; Soft Imaging Software, Мюнстер, Германия) и самодельных сценариев для автоматического сбора данных [разработанных Институт Кюри (С.Marco, T. Boudier, C. Messaoudi и S. Halary) и Служба электронной микроскопии Института интегративной биологии (J.-P. Lechaire) в Unité Mixte de Recherche 7138 Centre National de la Recherche Scientifique (F. Gaill и G. Frébourg; Messaoudi et al., 2003)]. Для восьми синапсов секции были повернуты на 90 °, и была получена другая серия, что позволило лучше визуализировать синапс, поскольку недостающая информация уменьшена. Изображения каждой томографической серии наклона были выровнены, угол наклона был рассчитан путем отслеживания золотых частиц, и окончательный объем был восстановлен с помощью взвешенного алгоритма обратной проекции с использованием программного обеспечения IMOD для одно- или двухосевой реконструкции (Kremer et al., 1996).
3D реконструкций.
Программное обеспечениеAMIRA (версия 3.1; Mercury Computer Systems, Сан-Диего, Калифорния) использовалось для трехмерной реконструкции синапсов. Контуры SV, постсинаптической плотности (PSD), плотного материала в синаптической щели или нитей, соединяющих SV, были нарисованы на каждом срезе. В качестве альтернативы для определения КА использовались сферы соответствующего диаметра. AZ была определена как пресинаптическая плазматическая мембрана рядом с электронно-плотным материалом, заполняющим синаптическую щель и / или PSD.Это соответствует определению синаптического соединения в межнейронных химических синапсах (Peters et al., 1991). Мы не наблюдали перфорированных синапсов в наших выборках, вероятно, из-за их низкой частоты встречаемости у молодых животных (Harris et al., 1992). SV оценивались как «пристыкованные», когда внешний слой их мембраны контактировал с внутренним слоем плазматической мембраны.
Количественная оценка.
После иммуноцитохимии синапсы регистрировали при увеличении 43000 × с использованием камеры Dualvision 300 Вт (Gatan, Grandchamp, France).Количество золотых частиц и их расстояние до пресинаптической мембраны в зоне АЗ были измерены на срезах, взятых у трех животных, с использованием программного обеспечения ImageJ (Abramoff et al., 2004).
После томографии общее количество СВ было подсчитано в 14 бутонах. В 18 синапсах поверхность PSD была измерена на ImageJ, и было определено количество пристыкованных SV.
Число филаментов, непосредственно связывающих везикулу с соседними с ней SV, было подсчитано на 52 SV из трех пресинаптических бутонов.Длину этих нитей, а также длину нитей, связывающих SV с плазматической мембраной, измеряли на AMIRA.
Для анализа пресинаптических окончаний у синапсинов TKO и контрольных мышей, синапсы позвоночника систематически оцифровывались с увеличением в 60000 раз в двух ячейках сетки, что позволяло анализировать 142 и 119 синапсов у контрольных мышей и мышей KO соответственно. Поверхность пресинаптических профилей, количество SV и их расстояние до АЗ были измерены с помощью ImageJ.Для обозначения границ бутонов была нарисована плазматическая мембрана пресинаптических профилей. Измерения проводились на трех TKO и трех контрольных мышах. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента t .
Результаты
Синаптическая морфология после HPF отличается от таковой после фиксации альдегида (Rostaing et al., 2006). В пресинаптическом окончании ВП менее плотно упакованы, и становится очевидным, что подгруппы ВС связаны между собой нитями (рис.1 А ). Организацию СВ внутри пресинаптических бутонов анализировали с помощью электронной томографии. Липидные бислои ВС и плазматической мембраны отчетливо проявлялись на виртуальных срезах, полученных из томограмм, и пристыкованные ВС можно было легко различить (рис. B , C ). Нитевидные структуры (далее называемые филаментами) можно было проследить на томограмме, и их связи с SV или плазматической мембраной можно было визуализировать.Некоторые филаменты связывают SV с плазматической мембраной, тогда как другие связывают SV вместе. Интересно, что некоторые пресинаптические филаменты, заканчивающиеся на мембране AZ, имеют аналоги, отходящие от постсинаптической мембраны. Такие симметричные пресинаптические и постсинаптические филаменты наблюдались примерно в половине проанализированных синапсов (рис. С ).
Фигура 1.Морфология пресинаптических окончаний на дендритных шипах после HPF. A , Ультратонкий срез толщиной 70 нм.Обратите внимание на присутствие пристыкованных SV (черная стрелка) и групп SV в терминале аксона (звездочка). Между ВП наблюдаются нити (белая стрелка). B , С , Виртуальные срезы томографической реконструкции синапса. Липидный бислой мембран, состыкованные SV (черная стрелка) и филаменты между SV (белая стрелка) хорошо видны.Обратите внимание на симметрично расположенные филаменты на пресинаптической и постсинаптической сторонах (черные стрелки). Масштабные линейки, 200 нм.
Организация СВ в пресинаптическом бутоне
Положение КА указывалось с помощью сфер соответствующего диаметра, нанесенных на томограммы. 3D-реконструкции показали, что, в отличие от их очевидной организации в подгруппах на стандартных сечениях, SV имели довольно однородное распределение (см.рис.6 А ).
Для анализа электронно-плотной сети, окружающей КА, плотности электронов, выходящих из КА, были нанесены на томографические срезы (рис. A ), тогда как электронно-плотные нити, не связанные с SV, для этой цели игнорировались. Трехмерная реконструкция по глубине томограммы выявила сложную сеть, окружающую КА (рис. В ). Каждая везикула была напрямую связана со средним значением 1.5 других SV ( n = 53 проанализированных SV) (рис. С ). С учетом их трехмерной ориентации размер этих нитей составил 32 ± 3 нм (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 43). Иногда КА находились в непосредственной близости друг от друга.
Фигура 2.Сеть нитей, соединяющих SV в пресинаптическом окончании. A , Электронно-плотные материалы, окружающие КА (желтые), наложены на виртуальный разрез. B , трехмерная реконструкция, подчеркивающая, что состыкованные (синий) и другие (золотые) SV встроены в плотную сеть нитей (розовый). С , Частичная реконструкция с большим увеличением, иллюстрирующая соединения (розовый цвет) между соседними SV. Масштабная шкала 200 нм.
Связи между ВС и пресинаптической мембраной
Нити между ВС и плазматической мембраной также наблюдались на томографических срезах (рис.3 A , B ). Пространственная организация этих филаментов прослеживалась на всех томограммах (рис. C – E ). Они вышли с большей плотностью из плазматической мембраны, обращенной к синаптической щели (рис. 4). Количество филаментов, связывающих ВП с пресинаптической мембраной, уменьшилось, тогда как расстояние от АЗ увеличилось (рис. 5). А ). В синапсах с большой АЗ (максимальный диаметр 420 ± 30 нм; среднее значение ± SEM; n = 2) все эти филаменты располагались рядом с АЗ (рис.4 C ), тогда как в синапсах с меньшей AZ (207 ± 24 нм; n = 4) (рис. D ) они также наблюдались за пределами АЗ. Их длина была сопоставима независимо от их происхождения в (60 ± 3 нм; n = 51) или за пределами (62 ± 4 нм; n = 46) АЗ (рис. B , C ).
Рисунок 3.Нити, соединяющие ВС с пресинаптической мембраной. A – E , Пример виртуальных разделов через один и тот же бутон. A , B , маломощный вид с КА в пристыкованном состоянии (стрелка) или на расстоянии (перечеркнутая стрелка). Нити соединяют СВ вместе (белая стрелка) или с плазматической мембраной (черная стрелка). Обратите внимание на короткие нити (белая стрелка) между купированным пузырьком (черная стрелка) и пресинаптической мембраной. C – E , Последовательность виртуальных срезов (один из шести последовательных срезов), устанавливающих непрерывность филамента (наконечники стрелок), соединяющего везикулу (перекрещенная стрелка) с пресинаптической мембраной. F – H , Пример нити, контактирующей с несколькими SV на виртуальных участках через другой бутон. Пять КА находятся в контакте с нитью накала (стрелки). I , 3D реконструкция волокон (розовый) и прилегающих SV.КА под номерами I — это те, что находятся в F – H . Масштабные линейки: A , B , 200 нм; C – H , 100 нм.
Рисунок 4.Распределение филаментов, связывающих ВС с пресинаптической мембраной. A – F , 3D-реконструкция нитей (розовый), соединяющих SV (золотой) с плазматической мембраной (светло-розовый). Пристыкованные КА отмечены синим цветом. Границы (стрелки) синаптического соединения определяются расширением щели (темно-синий). B — это тот же синапс, что и в A , на промежуточном этапе реконструкции накладывается виртуальный разрез. С , D , обратите внимание, что филаментов больше ( С ) или меньше ( D ) сосредоточены в АЗ. E , F , Примеры других синапсов после удаления плазматической мембраны.Масштабная шкала: 200 нм.
Рисунок 5.Количественная оценка распределения и длины филаментов, связывающих SV вместе или с плазматической мембраной. A , Распределение филаментов, связывающих SV с плазматической мембраной. B , Нити, связывающие ВП с плазматической мембраной, длиннее, чем между ВП (среднее значение ± стандартная ошибка среднего). С , Распределение длины нитей. Черные полосы — Нити, связывающие ВС с пресинаптической мембраной перед АЗ; серые полосы — нити, связывающие ВС с перисинаптической мембраной; белые полосы, нити, соединяющие SV вместе в бутоне.
Организация стыковки КА на АЗ
состыкованных SV не были равномерно распределены вдоль АЗ, как видно на изображениях синапса на ультратонких срезах (рис.6 В ). Для лучшего анализа их распределения пристыкованные КА были нарисованы поверх томограмм. PSD также был реконструирован для оценки площади АЗ. Затем 3D-реконструкции (пристыкованные КА плюс PSD) были повернуты для просмотра и (рис. 6). С ). Количество пристыкованных SV колебалось от 2 до 18 (7,6 ± 1,1; среднее ± SEM; n = 18). Когда присутствовало несколько пристыкованных КА, они, как правило, группировались. Несколько КА были также состыкованы за пределами АЗ, хотя и поблизости.В 1 из 18 случаев группа из трех пристыкованных SV была обнаружена на противоположной стороне плазматической мембраны по отношению к AZ. Интересно, что количество пристыкованных КА плохо коррелировало с общим количеством КА в бутоне (рис. D ). Однако это коррелировало ( p <0,05; n = 18) с размером PSD (рис. E ). Общее количество пузырьков не коррелировало с размером АЗ (данные не показаны).
Рисунок 6.Распространение SV. A , Для 3D-рендеринга SV были обнаружены на отдельных виртуальных участках, составляющих томограмму. Пристыкованные КА окрашены в фиолетовый цвет, остальные — в золотой. Расширение синаптического контакта определяется PSD (зеленый). B , На лицо вид синапса в ультратонком срезе.Пристыкованные КА (стрелки) неравномерно распределены в АЗ. С , 3D-реконструкции из томограмм пристыкованных КА по отношению к PSD. Синапсы упорядочены в соответствии с количеством пристыкованных SV. D , Отсутствие корреляции между количеством пристыкованных SV и общим количеством проанализированных SV в 14 синапсах. E , Корреляция между количеством пристыкованных SV и размером PSD в 18 синапсах.Масштабная шкала 200 нм.
На томографических серийных срезах состыкованные КА находились рядом с электронно-плотным материалом, сгруппированным на внутренней стороне плазматической мембраны (рис. A – F ). Трехмерные реконструкции и визуализированные изображения показывают, что большинство пристыкованных КА находились в контакте с этими пресинаптическими электронно-плотными структурами (рис. 7). G – I ).
Рисунок 7.Ассоциация состыкованных КА с пресинаптическими плотностями. A – F , Шесть виртуальных участков томограммы. Сечения разделены расстоянием ~ 19 нм по оси z . Пристыкованные КА (пронумерованные 1–4) прикреплены к пресинаптическому электронно-плотному материалу (звездочка). Нить накала (острие стрелки), выходящая из электронно-плотного материала, контактирует с КА. G – I , трехмерная реконструкция состыкованных SV (синий) и пресинаптического электронно-плотного материала (желтый) перед PSD (зеленый). G — это тот же синапс, что и в A – F . H и I — два других примера. Масштабные линейки: A – F , 50 нм.
Томографические срезы и 3D-реконструкции показали, что волокна образовались из-за электронной плотности в зоне АЗ.Большинство из них связались с СВ (рис. 7). А ). Некоторые из этих нитей контактировали с несколькими КА (рис. F – I ). Этот тип сборки был обнаружен хотя бы один раз для каждого синапса. Пристыкованные КА также наблюдались рядом с электронно-плотным материалом в основании этих нитей.
Картография пресинаптических белков по локализации иммунного золота
ФиксацияHPF с последующим внедрением Lowicryl позволяет создать реалистичную картографию синаптических молекул (Rostaing et al., 2006). Наблюдалась дифференциальная локализация синаптофизина, синапсина, фагота и CAST. Синаптофизин использовали в качестве маркера ВС. Его окраска была распределена по всему бутону (рис. 8). A , B ). Количественный анализ распределения синаптофизина показал некоторую метку, прилегающую к пресинаптической мембране, вероятно соответствующую стыкованным SV (рис. 8). Окрашивание синапсина практически не наблюдалось в первых 20 нм от АЗ (рис.8), но окрашивание синапсина наблюдалось по всей поверхности синаптического бутона, связанного с SV (рис.8 C , D ). Напротив, окрашивание фагота было кластеризованным, часто над волокнами, исходящими из плазматической мембраны в зоне АЗ (рис. 8). E , F ). Количественная оценка его распределения показала пик при ~ 70 нм (рис. 8). Иммуномечение CAST было сосредоточено в фокусных точках рядом с АЗ (рис. 8). G , H ), с пиком на ∼30 нм от АЗ (рис.8).
Рисунок 8.Постэлементная иммуноцитохимия пресинаптических белков на ультратонких срезах.Частицы иммунного золота обведены красным кружком. На вставках изображены частицы золота. A , B , Синаптофизин. С , D , Синапсин. E , F , Фагот. G , H , CAST. Показаны гистограммы для указанных антигенов процентного содержания золотых частиц в зависимости от их расстояния до мембраны (интервал, 20 нм). Стрелка указывает положение пресинаптической мембраны. n — количество проанализированных частиц золота. Масштабные линейки, 200 нм.
Организация SV в пресинаптических бутонах синапсина TKO мышей
Было высказано предположение, чтосинапсинов поддерживает ВС на расстоянии от АЗ (Pieribone et al., 1995; Takei et al., 1995; Гитлер и др., 2004). Здесь мы повторно проанализировали мышей TKO на наличие синапсинов, чтобы проверить эту гипотезу. Пресинаптические бутоны синапсина TKO содержали меньше SV, чем у контрольных мышей (рис. 9). A , B ). Количественная оценка показала уменьшение их количества на 63% (8 ± 1 пузырьков на бутон у TKO по сравнению с 23 ± 2 у контрольных животных; среднее значение ± SEM) (рис. 9). С ). Поверхность пресинаптических окончаний была уменьшена только на 18% у мышей TKO (рис.9 D ). Как следствие, большие части цитоматрицы бутона были лишены СВ (рис. 9). В ).
Рисунок 9.Морфология пресинаптических окончаний у мышей синапсина TKO. A , B , Ультратонкие секции управления ( A ) и техническим нокаутом ( B ) мышей. С . Количество SV снижено у мышей TKO (среднее ± SEM; p <0,01, тест Стьюдента t ). D . Площадь пресинаптических профилей снижена у мышей TKO ( p <0,05). E , Среднее расстояние КА от АЗ не изменилось. F , G , Распределение КА, обнаруженных на томограммах с участков контроля ( F ) или техническим нокаутом ( G ) мышей.Масштабные линейки, 200 нм.
Несмотря на сильное снижение их количества у мышей синапсина TKO, SV наблюдались во всем объеме синаптических бутонов (рис. B , G ). На отдельных томографических срезах небольшие филаменты, связывающие SV вместе, оставались у синапсинов TKO мышей. Нити между SV и плазматической мембраной также присутствовали у мышей TKO. Среднее расстояние SV от АЗ было почти идентично тому, которое измерялось у мышей дикого типа (рис.9 E ). Количество купированных везикул у TKO и контрольных животных было в пределах того же диапазона и сравнимо с подсчитанным у крыс дикого типа (см. Выше).
Обсуждение
Некоторые аспекты трехмерной архитектуры цитоматрицы были раскрыты с помощью HPF и томографической реконструкции. Наши исследования показали, что SV связаны между собой посредством плотной сети из филаментов, при этом один пузырек соединяется с ~ 1.5 ближайшими SV.Сеть SV, связанных вместе нитями, преимущественно связана с AZ более длинными нитями. На пресинаптической мембране, обращенной к синаптической щели, состыкованные SV находились в контакте с пресинаптическими электронно-плотными структурами.
Присутствие волокон, соединяющих ВП в варикозном расширении аксонов, согласуется с несколькими наблюдениями с использованием быстрого замораживания вместо фиксации альдегида (Landis et al., 1988; Hirokawa et al., 1989; Tatsuoka and Reese, 1989; Gotow et al., 1991). Длина этих филаментов (30–60 нм) вместе с их морфологией указывает на то, что они могут быть синапсинами (Landis et al., 1988; Hirokawa et al., 1989). Мы наблюдали среднюю длину нитей, соединяющих SV, около 30 нм. Эта длина совместима с размером молекул синапсина (Hirokawa et al. 1989). Иммунореактивность (ИР) синапсина была распределена по всему варикозному расширению, начиная с расстояния 20-40 нм от пресинаптической мембраны. Отсутствие иммунной метки в области, близкой к пресинаптической АЗ, согласуется с предыдущими исследованиями и согласуется с представлением о том, что синапсины необходимы для поддержания ВС на расстоянии от АЗ (Pieribone et al., 1995; Takei et al., 1995; Гитлер и др., 2004). В самом деле, сильное снижение количества SV наблюдалось у синапсиновых TKO мышей, начиная с 100 нм от AZ (Gitler et al., 2004). В соответствии с этими исследованиями мы также наблюдали сильное снижение количества SV у синапсиновых мышей TKO. Однако среднее расстояние от остальных КА до АЗ не изменилось. Уменьшения количества КА мы не наблюдали, так как расстояние от АЗ увеличилось. Предыдущие наблюдения можно отнести к фиксаторам альдегидов, которые вызывают сокращение пресинаптических окончаний (Rostaing et al., 2006). В самом деле, исследования пресинаптических окончаний у нематоды Caenorhabditis elegans показали, что HPF обеспечивает более реалистичную картину распределения SV, чем классическая электронная микроскопия (Weimer et al., 2006). Тем не менее, мы наблюдали умеренное уменьшение размера пресинаптических окончаний у синапсиновых мышей TKO, но меньше, чем обнаруженное при использовании альдегидов (Takei et al., 1995). Уменьшение размера пресинаптических окончаний было ниже (18%), чем ожидалось, учитывая сильное сокращение (63%) числа SV.Соответственно, большие части пресинаптических окончаний были лишены SV, что указывает на то, что (1) пресинаптическая цитоскелетная сеть поддерживает форму пресинаптических окончаний независимо от количества пузырьков в ней и (2) эта лежащая в основе цитоматрикс не зависит от целостности синапсина. Более того, тот факт, что нитчатые связи между SV все еще могут наблюдаться в TKO синапсинов, предполагает, что не все связывающие элементы между SV представляют синапсины.
Внутри бутонной цитоматрицы томографический анализ и 3D-реконструкции показали, что данный SV связан нитями с ∼1.5 других близлежащих космических аппаратов. Таким образом, SV заключены в плотную сеть нитей. Синапсины и другие молекулы, соединяющие SV, могут ограничивать движение SV и, таким образом, объяснять результаты недавних исследований визуализации в реальном времени, показывающие, что отдельные SV ограничены пресинаптическими окончаниями в состоянии покоя (Jordan et al., 2005; Lemke and Klingauf, 2005; Shtrahman et al. ., 2005; обсуждение см. В Gaffield et al., 2006). Связи между SV могут также объяснить, почему SV, перемещающиеся по аксону, оставались сгруппированными (Shepherd and Harris, 1998; Darcy et al., 2006). Рециклинг SVs в этой сети может быть вызван временной дисперсией синапсинов (Chi et al., 2001) и синапсин-опосредованной реорганизацией цитоматрикс (Bloom et al., 2003) во время потенциалов действия.
Мы наблюдали другую популяцию филаментов (~ 60 нм длиной), которые соединяют SV с плазматической мембраной. Следовательно, эти филаменты, которые также можно увидеть при быстром замораживании (Landis et al., 1988; Hirokawa et al., 1989), можно отличить от предыдущих как по их локализации, так и по длине.Их характер еще предстоит определить. 3D-реконструкции из виртуальных сечений, полученных из томограмм, теперь показывают, что они более распространены в зоне АЗ, чем внесинаптически. Таким образом, эти нити могут закрепить сеть мостовых SV перед АЗ. SV могут ускользать от пресинаптических окончаний и перемещаться по аксону, чтобы достичь др. Синаптических бутонов (Darcy et al., 2006). Следовательно, связи между SV и плазматической мембраной могут стабилизировать SV перед AZ. Несколько SV были обнаружены сближенными по длине некоторых из этих нитей.Таким образом, эти нити могут обеспечить путь для SV к зоне AZ.
Томографический анализ выявил ассоциацию состыкованных SV с пресинаптической плотностью в АЗ. В предыдущих исследованиях томография использовалась для анализа организации СВ в отношении пресинаптических плотностей в мешочковидных волосковых клетках или в нервно-мышечном соединении на материале, фиксированном альдегидами (Lenzi et al., 1999, 2002; Harlow et al., 2001) . В саккулярных волосковых клетках состыкованные СВ были обнаружены существенно ниже синаптического тела и сконцентрированы вокруг пресинаптических плотностей (Lenzi et al., 1999). В нервно-мышечном соединении состыкованные SV располагались параллельными рядами, соединенными с центральной линией плотного материала (или «лучей») с помощью филаментов [«ребер» (Harlow et al., 2001)]. Сами ребра контактируют с трансмембранными частицами («колышками»), которые могут быть потенциалозависимыми кальциевыми каналами. Таким образом, в этой системе регулярное расположение плотного материала соединяет состыкованные КА с кальциевыми каналами. Синапсы позвоночника гиппокампа демонстрируют иную ультраструктурную организацию. Пристыкованные SV не были расположены рядами, и наши наблюдения показали, что они были сгруппированы вокруг фокальных плотностей, которые сами по себе простирались только на небольшую часть пресинаптической мембраны, обращенную к синаптической щели.Это отличается от регулярно организованных плотных выступов, визуализируемых при окрашивании фосфорновольфрамовой кислотой. Этот регулярный паттерн, как теперь полагают, представляет коллапс цитоскелетных элементов вместе и между SV (для обсуждения см. Landis et al., 1988). Несмотря на различия в организации АЗ в периферических и центральных синапсах, эти плотности могут в обоих случаях служить в качестве связующего устройства, связывающего пристыкованные ВС с кальциевыми каналами для быстрого высвобождения нейротрансмиттера в ответ на приток кальция.
Осталось уточнить пространственную организацию молекулярных компонентов цитоматрикс. Идентифицировано несколько белков, участвующих в каркасе пресинаптического терминала (Schoch and Gundelfinger, 2006). Точнее, Piccolo, Bassoon, RIM и CAST (также известный как ERC2) образуют комплекс, локализованный в цитоматриксе, ассоциированном с АЗ (Cases-Langhoff et al., 1996; Wang et al., 1997, 2002; Tom Dieck et al. al., 1998; Ohtsuka et al., 2002; Takao-Rikitsu et al., 2004; Hagiwara et al., 2005; Weimer et al., 2006). Мы составили карту распределения синаптофизина, синапсина, фагота и CAST-IR по отношению к пресинаптической мембране в зоне АЗ. Синаптофизин-IR [трансмембранный белок SV (Südhof et al., 1987)] использовали в качестве общего маркера SV. CAST-, Bassoon- и synapsin-IR имели последовательное распределение относительно AZ. Наши наблюдения показывают, что CAST-IR ближе к плазматической мембране, чем Bassoon-IR. Было показано, что CAST напрямую взаимодействует с фаготом (Takao-Rikitsu et al., 2004). Взаимодействие CAST и фагота в синапсах позвоночника может быть очень похоже на то, что происходит в ленточном синапсе. В самом деле, в ленточных синапсах CAST располагается рядом с плазматической мембраной AZ и может быть связан с более удаленными белками с помощью Bassoon (tom Dieck et al., 2005). Ультраструктура пресинаптических бутонов нормальна у мутантных мышей, экспрессирующих белок Bassoon, лишенный области, участвующей в его прикреплении к AZ (Altrok et al., 2003). Однако структурно родственный белок Piccolo может выполнять функцию, аналогичную функции Bassoon (Fenster et al., 2000). В сетчатке мышей Bassoon KO лента в синапсе фоторецепторов отделяется от пресинаптической мембраны (Dick et al., 2003). Это указывает на то, что фагот играет роль в прикреплении ленты к пресинаптической АЗ. CAST также участвует в архитектуре пресинаптических терминалов. Bruchpilot, гомолог CAST Drosophila , необходим для формирования или поддержания пресинаптических плотностей (Т-столбиков) в нервно-мышечных соединениях Drosophila (Kittel et al., 2006; Wagh et al., 2006). В синапсах гиппокампа эти белки могут участвовать в формировании нитевидных связей между SV и AZ или в пресинаптических плотностях в AZ. Какой бы ни была его молекулярная организация, трехмерная архитектура цитоматрицы в пресинаптических окончаниях, выявленная в этом исследовании, подчеркивает морфологические ограничения, с помощью которых молекулярный каркас поддерживает SV перед AZ и организует их высвобождение в определенных областях пресинаптической мембраны.
Сноски
Эта работа была поддержана грантами L.S., A.T. и S.M .; от Европейской комиссии (SYNAPTOGENET и SynScaff) до A.T. и E.D.G .; из земли Саксония-Анхальт (N2) и Fonds der Chemischen Industrie и премией Макса Планка от Фонда Гумбольдта и Общества Макса Планка E.D.G .; и от Национального института здоровья (NS047209) до H.-Т.К. Эта работа также была поддержана регионом Иль-де-Франс (SESAME 95) для приобретения машины высокого давления Bal-Tec, программы GIP-HMR (2000; Aventis, Lyon, France) для приобретения TEM LEO 912. Omega cryostage и европейская сеть «3D-EM» для службы электронной микроскопии Institut Fédératif de Recherche 83 Biologie Integrative. Мы благодарим Жан-Луи Бессеро за стимулирующие обсуждения.
- Корреспонденцию следует направлять доктору Сержу Марти, Inserm U789, Ecole Normale Supérieure, 46 rue d’Ulm, 75005 Paris, France.smarty biologie.ens.fr
Фактор созревания Drosophila Duox является ключевым компонентом петли положительной обратной связи, которая поддерживает передачу сигналов регенерации
Цитата: Khan SJ, Abidi SNF, Skinner A, Tian Y, Smith-Bolton RK (2017) The Drosophila Фактор созревания Duox является ключевым компонентом петли положительной обратной связи, которая поддерживает передачу сигналов регенерации. PLoS Genet 13 (7): e1006937. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1006937
Редактор: Джованни Боско, Медицинская школа Гейзеля в Дартмуте, США
Поступила: 28 февраля 2017 г .; Принята к печати: 20 июля 2017 г .; Опубликовано: 28 июля 2017 г.
Авторские права: © 2017 Khan et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Доступность данных: Все файлы дифференциально экспрессируемых генов доступны в базе данных GEO (инвентарный номер GSE101797). Все другие соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.
Финансирование: Эта работа финансировалась Благотворительным фондом Роя Дж. Карвера Премией молодых исследователей (№ 12-4041), выданным RKSB, https://www.carvertrust.org, и Национальным институтом здравоохранения Национального института медицины США. Грант на общие медицинские науки R01 (№ R01 GM107140) RKSB, https: // www.nigms.nih.gov. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Введение
Способность восстанавливать поврежденные или потерянные органы или конечности у одних животных значительно выше, чем у других. Использование модельных организмов с различной степенью регенеративной способности, от регенерации всего тела у планарий и гидры до регенерации конечностей у земноводных, регенерации органов и плавников у рыбок данио, а также ограниченной регенерации тканей, которая происходит в моделях млекопитающих, продвинуло наше понимание этого процесса [рассмотрено в 1].Дополнительные инструменты, доступные в различных модельных организмах, позволили идентифицировать консервативные механизмы и сигнальные пути, которые используются во многих контекстах регенерации, таких как передача сигналов WNT [2-8], передача сигналов рецепторной тирозинкиназы (RTK) [9-16], передача сигналов Hippo. [17–22] и передача сигналов Jun N-terminal Kinase (JNK) [23–25], а также четкие различия в регенеративных механизмах между организмами и тканями [26,27].
Оценка изменений экспрессии генов в регенерирующей ткани — мощный подход к идентификации основных генов регенерации.Модельные организмы, которые поддаются мутагенезу, трансгеникам или нокдауну генов, опосредованных РНКи, также позволяют проводить функциональные исследования на основе результатов транскрипционного профилирования. Напр., Анализ транскриптома бластемы ноги сверчка выявил активацию компонентов пути передачи сигналов Jak / STAT, которая, когда ее нокаутировала с помощью РНКи, приводила к нарушению регенерации ноги [28]. Транскриптом из передней части планарии Procotyla fluviatilis , способной к регенерации после ампутации, сравнивали с транскриптомом из задних областей тела планарии, которые неспособны к регенерации, что позволило выявить активацию нескольких лигандов и рецепторов WNT после ампутации в ткань, которая не регенерирует.РНКи-нокдаун эффекторного β-катенина WNT восстанавливает регенеративную способность задней части животного [29]. У рыбок данио гены, регулирующие формирование передне-заднего паттерна во время регенерации плавников, были идентифицированы посредством транскрипционного профилирования передней и задней частей бластемы. Сверхэкспрессия одного из этих генов, hand2 (SO: 0000704), влияет на формирование паттерна, но не на рост во время регенерации [30]. Таким образом, профилирование транскрипции с последующим функциональным анализом является эффективным подходом к идентификации и проверке генов регенерации.
Drosophila melanogaster — один из самых мощных модельных организмов для генетического и функционального анализа генов. Более того, имагинальные диски Drosophila , эпителиальные структуры в личинке, которые будут формировать взрослых животных во время метаморфоза, были важной модельной системой для восстановления и регенерации тканей на протяжении более 60 лет [rev. 31]. Эта структура представляет собой простой эпителий, который содержит сложную структуру и определенную судьбу клеток. В то время как классические эксперименты по регенерации имагинального диска включали удаление ткани личинки перед ранением и культивирование в брюшной полости взрослого хозяина, разработка систем, использующих генетические инструменты для индукции абляции ткани in situ , позволила использовать высокопроизводительные экспериментальные подходы, такие как как генетический скрининг [6,32].В обоих методах индукции повреждения ткань закрывается раной и образует регенерационную бластему или зону пролиферирующих клеток рядом с раной [6,32–35]. Кроме того, оба метода индукции повреждений активируют передачу сигналов через Wingless и JNK пути [6,23,32,36–38].
Предыдущие исследования идентифицировали гены, дифференциально экспрессирующиеся во время регенерации имагинального диска. Blanco et al. вырезали имагинальные диски, а затем культивировали их на брюшках взрослых самок мух перед извлечением дисков в различные моменты времени во время регенерации для анализа микрочипов [39].В этом исследовании для микрочипов использовался весь имагинальный диск, включая ткани, не влияющие на бластему. Чтобы ограничить свой анализ клетками около места раны, которые вносят вклад в регенерацию, Katsuyama et al. аналогичным образом нарезали и культивировали диски, но использовали GFP-мечение клеток с активированной передачей сигналов JNK, чтобы пометить регенерирующую бластему для рассечения перед профилированием микроматрицы [40]. Вместе эти исследования использовали транскрипционное профилирование для идентификации нескольких генов и механизмов регенерации.Однако они использовали относительно небольшое количество клеток с нескольких регенерирующих дисков из-за технических проблем, присущих методике культивирования. Более того, культивирование само по себе может вызвать высокий уровень стресса в ткани, который может изменить профиль транскрипции.
Мы стремились создать полный и точный профиль транскрипции регенерирующей ткани имагинального диска, используя методы глубокого секвенирования и избегая культивирования ex vivo и микродиссекций. Индукция абляции ткани с использованием генетических инструментов позволяет протекать регенерации in vivo , как если бы ткань была повреждена хищником или паразитом в дикой природе.Кроме того, использование генетической системы абляции тканей способствует одновременной абляции и регенерации сотен имагинальных дисков, что позволяет собрать достаточный материал для мРНК-seq без необходимости амплификации. Наконец, функциональная проверка дифференциально экспрессируемых генов может быть проведена путем количественной оценки степени и качества регенерации после абляции ткани in situ у мутантов.
Здесь мы сообщаем о транскрипционном профиле регенерационной бластемы после абляции крылового мешка в крыловом имагинальном диске Drosophila во время пика регенеративного роста.Мы использовали метод, который оптимизирует нашу способность быстро и эффективно выделять флуоресцентно меченые клетки бластемы с диска [41], что позволяет собирать материал для мРНК-seq. Кроме того, мы функционально подтвердили несколько генов, которые по-разному экспрессируются во время регенерации, в качестве новых регуляторов регенерации. Важно отметить, что мы определили механизм, с помощью которого поддерживается передача сигналов регенерации для обеспечения повторного роста. Этот механизм включает петлю положительной обратной связи, которая требует фактора созревания DUOX NIP, который кодируется геном moladietz ( mol ) (FBgn0086711) [42].Путь передачи сигналов JNK, который важен для регенерации [23] и активируется ROS в месте повреждения [43], также активирует моль , который активирует Duox, тем самым поддерживая производство сигналов ROS и JNK. Эта петля положительной обратной связи поддерживает регенеративный ответ в течение нескольких дней после повреждения ткани. Таким образом, с помощью полногеномного транскрипционного профиля регенерирующей ткани мы идентифицировали изменения в экспрессии генов, которые контролируют ключевой регуляторный механизм регенеративного роста.
Результаты
Выделение меченых клеток бластемы
Мы индуцировали удаление большей части примордиального крыла путем экспрессии проапоптотического гена reaper (rpr) (FBgn0011706) [44] в домене экспрессии гена формирования паттерна крыла rotund (rn) (FBgn0267337) [45 ], который включает большую часть области карманов крыла имагинального диска крыла, через rnGAL4 , UASrpr [6] (Рис. 1A и 1B). Чтобы контролировать начало и завершение абляции ткани во времени, мы использовали температурные сдвиги для регулирования чувствительного к температуре репрессора Gal80 ts [46].Мы экспрессировали rpr в зачатке крыла в течение 24 часов в начале третьего возраста личинок, что привело к удалению большей части клеток, экспрессирующих rn , к концу абляции в воспроизводимой степени (время восстановления 0 часов или R0) ( Рис 1B) (S1 Рис). Клетки мешочка крыльев экспрессируют детерминанту крыла нуббин (нубин) (FBgn0085424) как во время нормального развития, так и во время регенерации [6,47]. Таким образом, экспрессия nub была удобным способом пометить клетки бластемы на этих поврежденных дисках, а также контрольные клетки на неповрежденных дисках.
Рис. 1. Маркировка и выделение регенеративных клеток бластемы.
( A-B) Имагинальные диски крыльев, которые не повреждены (A) или удалены, и в 0 часов восстановления (R0) (B). Зеленый = rnGal4 , UAS-EGFP . Красный = анти-Нуб. Синий = DAPI. (C) Крыльчатый имагинальный диск, демонстрирующий перекрытие иммуноокрашивания против Nub (красный) и экспрессии ловушки энхансера nub-GFP MiMIC (зеленый). (D-F) nub-GFP отмечает мешок крыльев через 24 часа (D), 48 часов (E) и 72 часа (F) после абляции.(G) nub-GFP (зеленый) совпадает с регенерационной бластемой, определяемой зоной высокого включения EdU (красный). (H) Схема процедуры мРНК-seq, от абляции ткани через диссоциацию и сортировку клеток до секвенирования и анализа данных. Шкала 100 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.g001
Чтобы маркировать регенерирующие клетки бластемы, мы идентифицировали общедоступную вставку транспозона MiMIC, которая экспрессирует GFP под контролем локуса nub [48].Экспрессия GFP через эту вставку происходит в тех же клетках, которые иммуноокрашены антителом против Nub (рис. 1C) [41,47]. Зачаток крыла продолжает экспрессировать nub-GFP после абляции и на протяжении разных стадий регенерации (Fig 1D-1F). GFP-экспрессирующие клетки также охватывают регенерационную бластему в R24, что отмечено включением EdU (рис. 1G), что подтверждает его пригодность в качестве маркера для бластемы и клеток контрольного мешочка крыла.
Чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируемые гены в бластеме, мы выполнили транскрипционное профилирование GFP-меченой и изолированной популяции клеток бластемы из крыловых имагинальных дисков R24 (Рис. 1H).Временная точка R24 была выбрана, поскольку она показывает четкую бластему, тогда как в более ранние временные точки некоторые диски еще не сформировали бластему, а в более поздние временные точки некоторые диски начинали воспроизводить заново отросшую ткань. Диссоциация и сортировка активируемых флуоресценцией клеток (FACS) клеток имагинального диска — это хорошо отработанная, но длительная процедура, которая может влиять на экспрессию генов и жизнеспособность клеток [49,50]. Поэтому мы оптимизировали наш процесс диссоциации клеток так, чтобы он был быстрым и мягким, занимая примерно 15 минут, чтобы минимизировать изменения в транскрипции и потерю жизнеспособности клеток из-за манипуляций с тканью [41].Мы ранее подтвердили точность сортировки с помощью количественной ПЦР для измерения экспрессии генов мешочков и не мешочков в отсортированных клетках [41]. После использования этого протокола для диссоциации и сортировки регенерирующих клеток бластемы и контрольных клеток крылового мешка мРНК была подготовлена и объединена таким образом, чтобы каждая биологическая реплика произвела достаточное количество мРНК для глубокого секвенирования (рис. 1H).
Идентификация дифференциально экспрессируемых генов в бластеме
Чтобы идентифицировать гены, которые дифференциально экспрессируются во время регенерации имагинального диска, мы собрали три независимых образца клеток бластемы, экспрессирующих nub-GFP , из регенерирующих дисков и три независимых образца клеток, экспрессирующих nub-GFP , из неповрежденных ‘ложно-удаленных’ ‘контрольные диски после 24 часов восстановления после термического сдвига (R24).В то время как контрольные образцы с имитацией абляции были взяты через термический сдвиг, в них отсутствовал UAS-rpr , поэтому абляция не производилась. Благодаря глубокому секвенированию мы получили около 27 миллионов считываний на реплику. Считывания были сопоставлены с использованием Tophat2 [51,52] против генома Drosophila melanogaster (NCBI, сборка 5.41). Всего с помощью Cuffdiff [51] было идентифицировано 3798 дифференциально экспрессируемых генов (p <0,05) с вероятностью ложного обнаружения 0,05.
В то время как log2 кратное изменение 1.5 часто устанавливается в качестве произвольного порога отсечения для дифференциально экспрессируемых генов, наш транскрипционный профиль показал log2-кратное изменение в 1,3 для гена , сморщенного (FBgn0243512), который представляет собой фосфатазу, которая одновременно является мишенью и негативным регулятором передачи сигналов JNK. в регенерационной бластеме [23,53], что побудило нас установить порог на 1,3. Таким образом, выбрав порог log2-кратного изменения ≥ 1,3 или ≤ -1,3, p <0,05, мы идентифицировали 660 статистически значимых дифференциально экспрессируемых генов, 504 из которых имеют повышенную регуляцию, а 156 - понижающую регуляцию в регенерационной бластеме (S1 и S2. Таблицы).
Несколько генов, ранее идентифицированных как гены регенерации имагинального диска, были активированы в нашем транскрипционном профиле, включая dilp8 [54], rgn и mmp1 [55], puckered [23] и myc [6] . Кроме того, мы обнаружили некоторое совпадение между нашим списком генов и дифференциально регулируемыми генами, отмеченными в двух ранее описанных профилях транскрипции регенерирующих имагинальных дисков (S2 Рис) [39,40]. Мы сравнили гены, которые были не менее log2 1.3-кратная повышающая или понижающая регуляция в нашем наборе данных и те же, по крайней мере в 1.3 раза повышающая или понижающая регуляция в анализе микроматрицы задней регенерирующей ткани через 24 часа после повреждения, представленного в Katsuyama et al., В котором они разрезают и культивировали имагинальные диски и использовали GFP-мечение клеток с активированной передачей сигналов JNK, чтобы пометить регенерационную бластему для вскрытия перед профилированием микроматрицы [40]. Общее с этим сообщением 32 гена, экспрессируемых по-разному (S2). Этот профиль привел их к изучению роли передачи сигналов JAK-STAT в регенерации диска [40].Важно отметить, что мы также идентифицировали сигнальный лиганд JAK / STAT upd / os (FBgn0004956) как высоко регулируемый в регенерирующей бластеме. Мы также сравнили гены, которые в нашем наборе данных были по крайней мере в 1,3 раза увеличены или уменьшены в log2, и гены, указанные как аналогично повышающие или понижающие регуляторы на рисунках и в таблицах, сообщающих об анализе микрочипов целых регенерирующих дисков через 24 часа после повреждения. представлен Blanco et al., поскольку весь список из 1183 генов, которые они идентифицировали как дифференциально экспрессируемые, не был опубликован [39].Было 10 дифференциально экспрессируемых генов, общих с этим отчетом (S2 Рис). Для этого анализа они вырезали и культивировали имагинальные диски и использовали целые диски для профилирования микрочипов [39]. Минимальное совпадение с предыдущими исследованиями может быть связано с несколькими факторами, включая различия в методе ранения (разрез по сравнению с абляцией ткани), используемых дисках (нога против крыла), условиях регенерации (культура по сравнению с in situ, ) и методом транскрипционного профилирования (микрочип с использованием нескольких дисков / бластем vs.mRNA-seq с использованием клеток, выделенных из сотен бластем). Кроме того, мы установили 1,3-кратный порог для определения дифференциально экспрессируемых генов, и снижение этого порога выявило бы большее совпадение между этими тремя исследованиями. Поразительно, но только один ген активируется во всех трех профилях транскрипции при использовании 1,3-кратного порога: yellow- b (FBgn0032601), который является мишенью передачи сигналов JNK во время дорсального закрытия [56]. Таким образом, текущий профиль транскрипции позволит изучить ранее не идентифицированные гены и пути регенерации.
Чтобы подтвердить, что наш транскрипционный профиль идентифицировал гены, которые действительно дифференциально регулируются в бластеме имагинального диска, мы использовали антитела, линии-ловушки для энхансеров и линии-ловушки для белков для визуализации экспрессии генов в неповрежденных и поврежденных крыльевых дисках. «Неповрежденные» контрольные диски отображают экспрессию этих генов во время нормального развития. Из 22 протестированных нами генов 16 (73%) экспрессировались по-разному, как и предполагалось. Подтвержденными активными генами были щелочная фосфатаза, 4 ( Alp4 / Aph5 ) (FBgn0016123) [57], Atf3 / A3-3 (FBgn0028550) [58], хронологически несоответствующий морфогенез (FBgn0028550) [5] FB867 (chinmo) ],
Ets21C (FBgn0005660) [60] и moladietz (моль) [42] (Рис. 2A – 2E).Паттерны экспрессии других генов изменились с повсеместных на ограниченные бластемой, такие как бесплодных (fru) (FBgn0004652) [61], LaminC (FBgn0010397) [62], AdoR (FBgn0039747) [63], и каяк (байдарка) (FBgn0001297) [64] (Рис. 2F и 2G, S3 Рис.). Третий класс генов показал сильную активацию вокруг бластемы и небольшую активацию в бластеме, включая маринованных яиц (свиньи) (FBgn0029881) [65] и репортер активности Stat92E (FBgn0016917), который отражает передачу сигналов, стимулированную upd . [66] (Рис. 2H и 2I).Гены Thor (FBgn0261560) [67], corto (FBgn0010313) [68], Nlaz (FBgn0053126) [69], twist (twi) (FBgn0003900) [70] и FBgn0004606) [71] продемонстрировали повышенную регуляцию транскрипционного профиля, но не показали повышенной экспрессии с окрашиванием антител ( twist ) или экспрессией энхансерной ловушки ( zfh2 , Thor и Nlaz ) или экспрессией белковой ловушки (). corto) (S3 Рис). Некоторые из этих генов могут быть активированы в профиле транскрипции, если в ходе регенерации шарнирные клетки превращаются в карманные клетки и начинают экспрессировать бугорка , при этом все еще экспрессируя некоторые специфичные для шарнира гены, такие как zfh2 .О таком превращении шарнира в мешочек сообщалось во время компенсаторной пролиферации [72,73], и экспрессия генов в этих переходных клетках все еще может быть важной для регенерации.
Рис. 2. Валидация генов, идентифицированных как активируемые в регенерационной бластеме.
Неповрежденные (A-I) и восстанавливающиеся (R24) (A’-I ’) диски крыльев. (A-A ’) Ловушка энхансера Alp4-lacZ . (B-B ’) Белковая ловушка Atf3-GFP. (C-C ’) энхансерная ловушка chinmo-lacZ . (D-D ’) Белковая ловушка Ets21C-GFP.(E-E ’) ловушка для энхансера mol-lacZ . (F-F ’) fas-lacZ энхансерная ловушка. (G-G ’) Ловушка для белка Lamin-GFP. (H-H ’) свиньи-ловушка-энхансер GFP . (I-I ’) 10xSTAT92E-GFP репортер активности STAT. Синяя пунктирная линия очерчивает зачаток крыла. Шкала 100 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.g002
Мы также подтвердили три из активированных генов с помощью количественной ПЦР целых дисков крыльев (S3 фиг.). Хотя кПЦР всего диска часто не позволяет выявить различия в экспрессии, которые возникают только в бластеме, поскольку бластема состоит из очень небольшого числа клеток по сравнению с остальной частью диска, изменения в экспрессии генов, которые в значительной степени не экспрессируются в диске до могут наблюдаться повреждения, такие как сморщенный [74].Таким образом, мы дополнительно подтвердили повышающую регуляцию Ets21C , mol и Nox как представителей дифференциально экспрессируемых генов (S3 фиг.).
Утвержденные гены с пониженной регуляцией: дефектного преджелудка (dve) [75], рецептор гормона 78 (Hr78), (FBgn0015239) [76], NC2β (FBgn0028926) [77], smooth (sm)
Рис. 3. Валидация генов, идентифицированных как подавляющие в регенерационной бластеме.
Неповрежденные (A-E) и восстанавливающиеся (R24) (A’-E ’) диски крыльев. (A-A ’) ловушка энхансера dve-lacZ . (B-B ’) Белковая ловушка Hr78-GFP. (C-C ’) Белковая ловушка NC2β-GFP. (D-D ’) sm-lacZ энхансерная ловушка. (E-E ’) Ловушка энхансера Cat-GFP . Синие пунктирные линии очерчивают зачаток крыла. Шкала 100 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.g003
Идентификация новых генов регенерации
Сильным преимуществом использования модельного организма, поддающегося генетической трактовке, является способность оценивать функциональную роль представляющих интерес генов, которые идентифицированы в профиле транскрипции. Чтобы оценить регенеративную способность имагинального крыла Drosophila , мы индуцировали абляцию ткани, как описано выше, у животных, которые были гетерозиготными мутантами по рассматриваемому гену. Затем регенерирующим животным позволяли развиваться до взрослого состояния и измеряли размер крыла для оценки степени регенерации.Чтобы измерить популяцию этих крыльев эффективно, они были отсортированы по классам, которые были примерно <25%, 25%, 50%, 75% и 100% размера нормального крыла (рис. 4A). Затем распределение мутантных регенерированных крыльев в этих классах сравнивали с распределением регенерированных крыльев, созданных контрольными животными. В нашей системе мы наблюдаем некоторую неоднородность в степени регенерации внутри генотипа, а также между контрольными экспериментами, проводимыми в разное время. Различия внутри каждого генотипа происходили из-за различий во времени окукливания каждого отдельного животного, при этом животные, у которых для регенерации было больше времени, имели большие крылья (S1, рис.) [6].Различия между экспериментами происходили из-за изменений в условиях окружающей среды, таких как влажность и качество пищи [74,80,81]. Несмотря на эту очевидную гетерогенность, мы находим воспроизводимые различия между мутантными и контрольными животными, используя этот метод скрининга, и успешно идентифицировали гены, которые регулируют определенные аспекты регенерации [6,74,81,82]. Используя этот метод, мы протестировали доступные мутанты в генах, которые были сильно активированы после повреждения ткани. Двенадцать из 16 или 75% генов, которые мы тестировали, показали фенотип регенерации, что неудивительно, учитывая, что не все важные гены регенерации будут иметь фенотип, когда только гетерозиготный мутант и не все дифференциально экспрессируемые гены будут важны для регенерации.Одним из примеров гена с повышенной регуляцией, необходимого для регенерации, является Ets21c , который кодирует фактор транскрипции, который является известной мишенью передачи сигналов JNK и важен для активности JNK во врожденном иммунном ответе [83] во время образования опухоли [84, 85] и при эпидермальных ранах [86]. После абляции и регенерации имагинальной ткани крылья взрослых животных у Ets21c f03639 / + животных были меньше контрольных (рис. 4B). Второй пример гена с повышенной регуляцией, который требуется для регенерации, — это CG9336 (FBgn0032897), который аннотирован в геноме Drosophila и имеет близкородственные гомологи у других видов Drosophila , но не у позвоночных, и, по-видимому, не проявляет себя. имеют белковые домены с известной функцией.После удаления и регенерации зачатка крыла у животных CG9336 MI03849 / + полученные крылья взрослых были меньше контрольных, что указывает на потребность в этом гене во время регенерации (рис. 4C). Дополнительные гены, необходимые для регенерации, включали щелочную фосфатазу 4 ( Alp-4 ) [57], ген 4E-BP Thor [67], moladietz (mol) [42], а также компоненты коллагена. Коллаген типа IV альфа 1 (Col4a1 / Cg25C) (FBgn0000299) [87] и viking (vkg) (FBgn0016075) [88] (Рис. 4D – 4G).
Рис. 4. Генетические анализы, демонстрирующие, что дифференциально экспрессируемые гены играют функциональную роль в регенерации.
( A) Типичные примеры крыльев из поврежденных дисков, которые составляют примерно <25%, 25%, 50%, 75% и 100% от нормального крыла. Шкала шкалы 1 мм. (B-G) Размеры взрослых крыльев после регенерации у контрольных ( w 1118 ) и гетерозиготных мутантных животных. Каждый из трех независимых экспериментов, погрешности — SEM. (B) Размеры взрослых крыльев после регенерации у w 1118 и Ets21C f03639 / + животных. w 1118 n = 318 крыльев, Ets21C f03639 / + n = 255 крыльев, p <0,0001 с использованием критерия хи-квадрат. (C) Размеры взрослых крыльев после регенерации у w 1118 и CG9336 MI03849 / + животных. w 1118 n = 374 крыла, CG9336 MI03849 / + n = 215 крыльев, p <0.0001 по критерию хи-квадрат. (D) Размеры взрослых крыльев после регенерации у w 1118 и Alp4 07028 / + животных. w 1118 n = 239 крыльев, Alp4 07028 / + n = 217 крыльев, p <0,0001 по критерию хи-квадрат. (E) Размеры взрослых крыльев после регенерации у w 1118 и Thor 06270 / + животных. w 1118 n = 224 крыла, Тор 06270 / + n = 146 крыльев, p = 0,0021 по критерию хи-квадрат. (F) Размеры взрослых крыльев после регенерации у w 1118 и mol e02670 / + животных. Три независимых эксперимента, w 1118 n = 356 крыльев, моль e02670 / + n = 183 крыла, p = 0.00001 по критерию хи-квадрат. (G) Размеры взрослых крыльев после регенерации в w 1118 , Col4a1 k00405 / + и vkg k00236 909 w 1118 n = 320 крыльев, Col4a1 k00405 / + n = 71 крыло и vkg k00236 / + / + 0.0001 по критерию хи-квадрат.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.g004
Интересно, что некоторые из протестированных мутантов не оказали ожидаемого эффекта на регенерацию. Вместо того, чтобы вести к плохой регенерации, мутации в подмножестве активированных генов усиливали регенерацию при гетерозиготности. Эти гены включали бессердечных (htl) (FBgn0010389) [89] и fru [61] при оценке у мужчин (S4 Рис). После абляции и регенерации размеры крыльев у этих мутантов были больше, чем у контрольных крыльев.Механизмы, с помощью которых эти гены ограничивают регенерацию, еще не изучены.
Биологические процессы, затронутые при регенерации
Чтобы идентифицировать биологические процессы, которые могут быть затронуты во время регенерации, мы провели анализ обогащения онтологии генов (GO). Транскрипты, регуляция которых была значительно повышена или понижена, были проанализированы в соответствии с категориями GO с использованием DAVID v6.7 [90,91]. Репрезентативные термины GO из наиболее значительно обогащенных кластеров GO, описывающие биологические процессы, перечислены в таблице 1.Термины, которые были обогащены среди активированных генов, включали развитие имагинального диска и формирование паттерна имагинального диска, вероятно, потому, что регенерирующая ткань восстанавливала то, что было удалено. Обогащение GO терминами морфогенез клеток, морфогенез тканей, адгезия клеток, морфогенез эпителия и миграция клеток может происходить из-за того, что клетки на краю раны меняют форму, чтобы закрыть рану [32]. Кроме того, нарушение непрерывности меченых клонов в регенерирующей ткани указывает на то, что клетки интеркалируют и смещаются относительно друг друга во время регенерации имагинального диска [92].Термин GO-регуляция транскрипции, вероятно, содержит факторы транскрипции, необходимые для выполнения программы регенерации, а также развития и формирования паттерна регенерирующей ткани. Интересно, что термин GO «развитие открытой трахеальной системы» был очень обогащен. Две возможные причины этого очевидного обогащения включают загрязнение отсортированных нами клеток трахеальными клетками или активацию в бластеме тех же генов сигнального пути RTK, которые играют критическую роль в морфогенезе трахеальной системы, как это наблюдалось при компенсаторной пролиферации [93].Другой высокообогащенный кластер GO включает термины «негативная регуляция клеточной дифференцировки», «регуляция коммитирования клеточных судеб» и «регуляция спецификации клеточных судеб». Интересно, что мы и другие показали, что повреждение имагинального диска вызывает временную потерю маркеров спецификации клеточной судьбы [6,94].
Многие из терминов GO биологического процесса, обогащенные среди подавленных генов, описывают общие клеточные процессы, включая внутриклеточный транспорт и транспорт, опосредованный пузырьками, процессинг РНК и катаболизм.Интересно, что несколько классов генов, которые влияют на клеточный метаболизм, были подавлены, в том числе GO-термины, перенос электронов, связанный с синтезом АТФ в митохондриях, метаболический процесс ацетил-КоА, цикл трикарбоновых кислот и аэробное дыхание. В то время как транскрипционный профиль регенеративного зачатка хвоста головастика Xenopus tropicalis аналогичным образом предполагает изменения клеточного метаболизма после повреждения ткани [95], широкая функциональная роль клеточно-автономных изменений в окислительном фосфорилировании, гликолизе или другой клеточной энергетике во время регенерации имеет еще предстоит продемонстрировать.
Регуляторы активных форм кислорода дифференциально выражаются во время регенерации
Дополнительной категорией пониженной регуляции ГО был окислительно-восстановительный гомеостаз клеток, предполагающий изменения в уровнях ферментов, которые регулируют активные формы кислорода (АФК) в регенерационной бластеме. В самом деле, ROS обеспечивают важную передачу сигналов в других модельных системах заживления и регенерации ран [rev. 96]. Например, АФК служат в качестве аттрактанта для иммунных клеток в хвостах личинок рыбок данио после ампутации [97] и в ранах кутикулы Drosophila [98], а также необходимы для пролиферации и регенерации после ампутации хвоста головастика Xenopus [99]. как отрастание плавника и аксона после ампутации хвоста рыбок данио [100,101].Более того, ROS стимулируют передачу сигналов JNK в регенерирующих плавниках рыбок данио и имагинальных дисках Drosophila [43,102,103]. Во время регенерации крылатого имагинального диска АФК высвобождаются умирающими клетками, а затем поглощаются живыми клетками на краю раны сразу после физического повреждения или индукции абляции ткани [43]. Однако степень, в которой АФК продуцируются и распространяются в регенеративной бластеме, а также механизм, лежащий в основе продукции АФК в отрастающей ткани, неясны.
Мы исследовали экспрессию генов, которые регулируют производство и удаление АФК в нашем транскрипционном профиле бластемы регенерации имагинального диска, и обнаружили, что помимо генов с пониженной регуляцией, идентифицированных с помощью анализа ГО, среди активированных генов также присутствовали факторы, регулирующие АФК. (Таблица 2). Drosophila имеет две НАДФН-оксидазы, которые продуцируют АФК, НАДФН-оксидазу (Nox) (FBgn0085428) и дуальную оксидазу (Duox) (FBgn0283531) [104–107]. Интересно, что экспрессия Nox была повышена, в то время как экспрессия Duox оставалась неизменной.Однако фактор созревания Duox DUOXA / NIP, который кодируется геном moladietz (mol) [42], показал высокий уровень индукции после повреждения, что представляет собой одно из самых сильных попаданий в профиль. Чтобы уменьшить АФК, супероксид и перекись водорода поглощаются супероксиддисмутазой (Sods) и каталазой (Cat), соответственно. Экспрессия CuZn-зависимой цитоплазматической Sod1 (FBgn0003462) [108] и Mn-зависимой митохондриальной Sod2 (FBgn0010213) [109] была снижена в регенеративной бластеме, а внеклеточной Sod3 (FBgn00631) [11033631] остались без изменений.Более того, экспрессия Cat [79] сильно снижена. Таким образом, образование и распространение ROS в регенеративной бластеме можно частично объяснить активацией транскрипции Nox и моль / NIP и подавлением Sod1, Sod2 и Cat.
ROS требуется для поддержания сигнализации регенерации
В то время как регенерирующие хвосты рыбок данио демонстрируют продукцию ROS в течение как минимум 24 часов после ампутации [102], а хвосты головастиков Xenopus производят ROS в течение нескольких дней после ампутации [99], производство ROS в поврежденных дисках крыльев оценивалось только в течение 30 минут после физического повреждения и Через 11 часов после индукции абляции тканей [43].Чтобы определить, сохраняются ли АФК в регенерирующих дисках крыльев, мы использовали окрашивание дигидроэтидием (ДГЭ) для обнаружения АФК. Важно отметить, что мы наблюдали флуоресценцию DHE в клеточном остатке и в бластеме регенерации в R24 (Фиг.5A и 5B) и R48 (Фиг.6F). Мы подтвердили этот вывод с помощью детектора АФК H 2 DCFDA (S6 Рис). Таким образом, АФК сохраняются в живых регенерирующих клетках в течение как минимум 24 часов после завершения абляции ткани, что свидетельствует об активном механизме, который поддерживает производство АФК в регенерирующей ткани.
Рис. 5. АФК сохраняются в регенерационной бластеме и необходимы для регенерации.
(A-B) Окрашивание DHE (красный) для обнаружения ROS. Подкрылка имеет маркировку , выступ-GFP (зеленый). Желтыми звездочками отмечены карманы клеточного мусора. (A) Неповрежденный диск. (B) Регенерационный диск на R24. (C-D) Анализ генетической регенерации с использованием размера крыла взрослой особи для оценки степени регенеративного роста имагинальных дисков. По три независимых эксперимента для каждого. (C) Размеры взрослых крыльев после регенерации у w 1118 и UAS-Sod1 / + животных. w 1118 n = 375 крыльев, UAS-Sod1 / + n = 166 крыльев, p <0,0001 с использованием критерия хи-квадрат. (D) Размеры взрослых крыльев после регенерации у животных w 1118 , UAS-Sod2 / + и UAS-Cat / + животных. w 1118 n = 327 крыльев, UAS-Sod2 / + n = 332 крыла, UAS-Cat / + n = 361 крыло, p <0,0001 с использованием критерия хи-квадрат. (E-H) Anti-Nub отмечает зачаток крыльев w 1118 (E, F) и UAS-Sod1 (G, H) регенерирующих дисков на R24 и R48.(I) Количественная оценка площади зачатка крыла, отмеченной антинубусом в R24 и R48. w 1118 R24 всего n = 12 дисков, UAS-Sod1 R24 n = 15 дисков, w 1118 R48 n = 5 дисков, UAS-Sod1 R48 n = 10 дисков . При R48 p = 0,0248. (JK) Скорости пупарирования. Обратите внимание, что из-за температурных сдвигов в протоколе абляции время регенерации и неповрежденного окукливания нельзя сравнивать друг с другом.(J) Время окукливания после регенерации. Три независимых эксперимента, контроль n = 213 куколок, UAS-Sod1, n = 107 куколок. (K) Время окукливания во время нормального развития. Три независимых эксперимента, контроль n = 173 куколки, UAS-Sod1, n = 201 куколка. (L-O) Экспрессия репортера TRE-red указывает на сигнальную активность JNK в регенерирующих дисках w 1118 (L, M) и UAS-Sod1 (N, O) в R24 и R48. (P) Количественная оценка флуоресценции TRE-red на R24 и R48.* р <0,00002. w 1118 R24 n = 10 дисков, UAS-Sod1 R24 n = 14 дисков, w 1118 R48 n = 10 дисков, UAS-Sod1 R48 n = 14 дисков. Шкала 100 мкм. Планки погрешностей — SEM.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.g005
Рис. 6. Для регенерации крыльевого диска требуется moladietz .
( A-D) Флуоресценция DHE (красный цвет) указывает на присутствие ROS. nub-GFP (зеленый) отмечает регенерирующий мешок крыла. (A-B) Конфокальные срезы регенерирующего диска w 1118 через поле обломков (A, A ’) и эпителий диска (B, B’). Звездочками отмечены обломки клеток в области обломков и в нескольких складках эпителия. Стрелка указывает на положение регенерирующего крыльевого мешка. (C-D) Конфокальные срезы регенерирующего диска моль e02670 / + через поле дебриса (C, C ’) и регенерирующий эпителий (D, D’).Звездочка и стрелка такие же, как указано выше. (EF) Количественная оценка интенсивности флуоресценции DHE в полях обломков w 1118 и моль e02670 / + регенерирующих дисков (E) и регенерирующего эпителия w 1118 и mol e02670 / + регенерирующие диски и контроль неповрежденных дисков (F). Для R24, три независимых эксперимента, всего w 1118 регенерация n = 12 дисков, моль e02670 / + регенерация n = 18 дисков, w 904 1118 909 неповрежденных n = 11 дисков.Для R48 три независимых эксперимента, всего w 1118 регенерация n = 30 дисков, моль e02670 / + регенерация n = 25 дисков, w 1118 n = 10 дисков. (G, H) Количественная оценка флуоресценции GFP от репортера gstD-GFP для регулируемой ROS транскрипции при регенерации дисков w 1118 и моль e02670 / + дисков.Для R24, w 1118 n = 12 дисков, моль e02670 / + n = 20 дисков. Для R48, w 1118 n = 12 дисков, моль e02670 / + n = 10 дисков. (I) Площадь крыла взрослой особи в w 1118 и mol e02670 / + мужские и женские крылья от неповрежденных дисков и после регенерации диска.Три независимых эксперимента. Неповрежденные: w 1118 самок n = 125 крыльев, w 1118 самцов n = 132 крыла, моль e02670 / + 909 моль крыльев самок e02670 / + самцов n = 73 крыла. Регенерированные: w 1118 самок n = 226 крыльев, w 1118 самцов n = 134 крыла, моль e02670 / + 909 моль крыльев самок e02670 / + самцов n = 133 крыла.(JO) Anti-Nub отмечает регенерирующий зачаток крыла в R0, R24 и R48 в дисках w 1118 и mol e02670 / + . (P) Количественная оценка размера регенерирующего зачатка крыла в точках R0, R24 и R48. R0 w 1118 n = 26 и моль e02670 / + n = 29, R24 w 1118 n = 42 и 3 моль / + n = 41, R48 w 1118 n = 29 и моль e02670 / + n = 42.Шкала 100 мкм. Планки погрешностей — SEM. ** p <0,05, * p <0,005, *** p <0,0002, **** p <0,0001.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.g006
Чтобы определить степень, в которой изменения в уровнях ROS влияют на регенерацию, мы сверхэкспрессировали Sod1, Sod2 или Cat в удаленных дисках с помощью UAS-Sod1 [111], UAS-Sod2 [112] или UAS-Cat [113] трансген под контролем rn-GAL4 , который индуцировал экспрессию в удаленной ткани, а также в немногих выживших rn -экспрессирующие клетки, которые внесли свой вклад в бластему.Эта ограниченная сверхэкспрессия предназначалась для снижения уровней ROS в дебрисах и частичного снижения уровней ROS в бластеме, поскольку не все клетки бластемы экспрессировали трансгены. Согласно предыдущему сообщению, подобная избыточная экспрессия Sod1 или Cat по отдельности или вместе снижает способность крыльевых дисков восстанавливаться после абляции ткани [43]. В нашей системе абляции сверхэкспрессия Sod1 или Sod2 во время абляции аналогичным образом приводила к меньшим размерам крыльев взрослых особей по сравнению с контролем, хотя избыточная экспрессия только Cat не приводила, подтверждая, что манипуляции с уровнями ферментов, регулирующих АФК, влияют на регенерацию (рис. 5C и 5D).Снижение регенерации, вероятно, было связано с комбинацией замедленного регенеративного роста, так как UAS-Sod1 регенерирующих зачатков крыльев отставали от контрольных по размеру (рис. 5E-5I) и сокращением времени регенерации, как UAS-Sod1 регенерирующих животных не смогли отсрочить пупариацию в ответ на повреждение ткани так долго, как контроли (рис. 5J и 5K). Поврежденные диски с временно сверхэкспрессией Sod1 также обладают сниженной передачей сигналов JNK на R24, что наблюдается по экспрессии транскрипционного репортера TRE-red для активности пути JNK [114] (Fig. 5L-5P).
В поврежденных имагинальных дисках глаза ROS рекрутируют гемоциты в место повреждения, которые затем стимулируют передачу сигналов JNK в восстанавливающемся эпителии [103]. Чтобы определить, рекрутируются ли гемоциты в крыловой диск в ответ на удаление домена, экспрессирующего rn , мы наблюдали гемоциты с использованием Hemolectin-RFP (FBgn0029167) [115] и антитела против Нимрода (FBgn0259896) [116]. В контрольных дисках небольшие скопления гемоцитов наблюдались в складках 1 из 15 дисков (S5 Рис.). В поврежденной и регенерирующей ткани скопления гемоцитов наблюдались в 4 из 15 дисков вдоль периподиального эпителия.Эти гемоциты присутствовали в непосредственной близости от обломков, но не находились в прямом контакте с обломками, которые были захвачены между двумя эпителиальными слоями (S5, фиг.). Т.о., в отличие от глазного диска, рекрутирование гемоцитов вряд ли будет основным механизмом, посредством которого ROS индуцируют передачу сигналов JNK в крыловом диске.
Фактор созревания DUOX
moladietz / NIP необходим для производства ROS в регенерационной бластемеПоразительная повышающая регуляция моль в регенерационной бластеме с помощью R24 и его продолжающаяся экспрессия посредством R48 (Fig 2E, S8 Fig) предполагают, что его белковый продукт NIP может играть важную роль в регуляции регенерации.Важно, что mol обычно экспрессируется на низких уровнях в крыловом диске во время развития (Fig 2E, S6 Fig). Гомолог NIP у позвоночных, фактор созревания DUOX (DUOXA) (HGNC: 26507), важен для перемещения DUOX через эндоплазматический ретикулум и golgi к поверхности клетки [117]. Попадая на поверхность клетки, DUOXA остается в стабильном комплексе с DUOX и увеличивает скорость и специфичность продукции ROS [118]. Таким образом, регуляция транскрипции моль может иметь сильное влияние на продукцию ROS в регенерирующем эпителии.
Чтобы определить степень, в которой усиление транскрипции моль способствует продукции АФК в бластеме, мы оценили уровни АФК у гетерозиготных моль нулевых мутантных животных. Duox может производить как перекись водорода, так и супероксид [118]. Поскольку DHE был реагентом, который лучше всего работал с имагинальными дисками (рис. 5A и 5B, рис. S6), мы использовали его в качестве репрезентативного анализа для общих уровней ROS. Интересно, что продукция ROS как в клеточном дебрисе, так и в бластеме регенерации была значительно снижена в поврежденных дисках с моль e02670 / + (рис. 6A – 6F), что указывает на то, что для общей ROS требуется моль продукция после повреждения тканей.Чтобы подтвердить, что ответ на ROS снижен в регенерирующей ткани моль e02670 / + , мы оценили экспрессию репортерного трансгена gstD1-GFP (FBgn0001149), который отвечает на активацию, индуцированную ROS. транскрипции [119]. Интересно, что экспрессия gstD1-GFP была значительно снижена в бластемах мутантной регенерации, но не раньше, чем через два дня после повреждения ткани (фиг. 6G и 6H; S6 фиг.).
Наш первоначальный генетический анализ показал, что NIP требуется для регенерации (рис. 4F).Чтобы количественно оценить эффект уменьшения НИП, мы измерили размер крыла взрослой особи в моль e02670 / + самок и самцов после абляции и регенерации имагинального диска. Важно отметить, что в то время как нормальные крылья были одинакового размера у контрольных животных и моль e02670 / + животных, регенерированные моль e02670 / + крылья были значительно меньше, чем регенерированные контроли, что указывает на то, что регенерация у этих моль e02670 / + животных было нарушено (рис. 6I).Чтобы подтвердить потребность в моль , мы также количественно оценили регенерацию с использованием дисков, экспрессирующих мольРНКи в регенерирующем пакете крыльев, с использованием трансгена UAS-molRNAi . Хотя такая экспрессия RNAi была ограничена во времени и пространстве, мы обнаружили, что она эффективна для генерации фенотипов в нашей системе [74], возможно, из-за распространения нокдауна после ограниченной экспрессии RNAi, наблюдаемой в имагинальных дисках [120]. Важно отметить, что диски, экспрессирующие molRNAi , также регенерировали хуже, чем контроли, по размеру крыла взрослых особей (S6 Fig).
Чтобы понять, как сниженная экспрессия mol ухудшает регенерацию, мы контролировали повторный рост удаленной ткани, измеряя площадь зачатка крыла в определенные моменты времени после завершения абляции. Мы обнаружили, что моль e02670 / + регенерирующие диски были немного меньше контрольных, начинающихся на ранней стадии регенерации, и значительно отставали от контрольных по размеру на два дня после повреждения ткани (Рис. 6J – 6P).
Фактор созревания DUOX
moladietz / NIP необходим для устойчивой передачи сигналов JNK во время регенерацииУчитывая, что разница в повторном росте была более очевидной позже при регенерации, мы предположили, что снижение уровней NIP может быть особенно важным для более поздних стадий регенерации.В самом деле, экспрессия ростового промотора Myc (FBgn0262656), который важен для регенеративного роста [6], была сопоставима с контролем на R24, но снижалась на R48 (S6 Fig). Поскольку ROS стимулируют передачу сигналов JNK в поврежденных имагинальных дисках [43], мы исследовали уровни передачи сигналов JNK в моль e02670 / + регенерирующих дисках. Важно отметить, что экспрессия сигнального репортера JNK TRE-red , который отражает активность транскрипционного комплекса AP-1, была немного снижена во время ранней и средней регенерации (R0, R24 и R48) и заметно снижена на поздних стадиях регенерация в моль e02670 / + дисков (R72) (Рис. 7A – 7J).Чтобы определить, может ли усиление передачи сигналов JNK компенсировать снижение уровней NIP и продукции АФК, мы исследовали крылья взрослых после повреждения и регенерации у животных, гетерозиготных по моль и отрицательному регулятору передачи сигналов JNK , сморщенный ( puc ) [53]. Эти моль e02670 / +; puc E69 / + регенерированные крылья были значительно больше, чем моль e02670 / + регенерированные крылья, что указывает на то, что усиленная передача сигналов JNK может обойти требование моль и спасти бедных фенотип регенерации мутантов mol e02670 / + (рис. 7K).Таким образом, повышающая регуляция моль необходима для распространения ROS в регенерационной бластеме и для поддержания передачи сигналов JNK, особенно на более поздних стадиях регенерации.
Рис. 7. NIP требуется для поддержки передачи сигналов JNK во время поздней регенерации.
( AH) Конфокальные изображения флуоресценции репортера TRE-red для передачи сигналов JNK в w 1118 (AD) и моль e02670 / E +H / E +H восстанавливающие диски в точках R0 (A, B), R24 (B, F), R48 (C, G) и R72 (D, H).(I) Количественная оценка интенсивности флуоресценции репортера TRE-red в максимальных проекциях конфокальных изображений в точке R0, поскольку в этот момент времени эпителий нельзя отличить от мусора. w 1118 n = 10 дисков, моль e02670 / + n = 14 дисков. (J) Количественная оценка интенсивности флуоресценции репортера TRE-red в отдельных срезах конфокальных изображений через регенерирующий эпителий в R24, R48 и R72.R24 w 1118 n = 11 дисков, моль e02670 / + n = 11 дисков. R48 w 1118 = 14 дисков, моль e02670 / + n = 15 дисков. R72 w 1118 n = 11 дисков, моль e02670 / + n = 11 дисков. (K) Анализ регенерации с использованием размера крыла взрослой особи для оценки степени регенеративного роста имагинальных дисков в w 1118 , моль e02670 / + , puc E69 / + и моль e02670 / +; puc E69 / + животных.Два независимых эксперимента, таким образом, погрешности — стандартное отклонение. w 1118 n = 26 крыльев, mol e02670 / + n = 83 крыла, puc E69 / + n = 99 mol e02670 / +; puc E69 / + n = 95 крыльев. p <0,0001 для всех сравнений с использованием критерия хи-квадрат. Пунктирная синяя линия очерчивает зачаток крыла.Шкала 100 мкм. Планки погрешностей - это SEM, если не указано иное. * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,0001.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.g007
Важность фактора созревания Duox в регенерации подразумевает, что сам Duox также важен для регенерации, даже если он не регулируется транскрипционно в соответствии с нашим профилем . Чтобы оценить важность Duox, мы количественно оценили регенерацию у UAS — DuoxRNAi животных.Действительно, крыловые диски, экспрессирующие DuoxRNAi , регенерировали плохо по сравнению с контрольными животными (S7 фиг.).
Другим важным регулятором ROS, который активируется в профиле транскрипции, является НАДФН-оксидаза Nox. Чтобы определить, требуется ли Nox также для регенерации крыльевых дисков, мы сравнили крылья взрослых особей после повреждения и регенерации у контрольных животных и животных, гетерозиготных по мутанту Nox ( Nox MI15634 ) или экспрессирующих NoxRNAi .Интересно, что как мутация Nox , так и мутация NoxRNAi вызывали улучшенную регенерацию, что оценивается по размеру крыла взрослой особи (S7 рис.). Чтобы понять, почему уменьшение Nox привело к усилению регенерации, мы оценили размер мешочка во время регенерации и скорость окукливания. Интересно, что крыловые диски с уменьшенным Nox восстанавливались с той же скоростью, что и контрольные диски через R48, и время окукливания не изменялось (S7 Рис). Таким образом, ограничение Nox на регенерацию должно произойти после R48, возможно, во время фазы куколки.Эти результаты предполагают, что ROS, продуцируемые Nox и комплексом Duox / NIP, вероятно, функционально, пространственно или временно различаются, причем ROS, продуцируемые Nox, действуют, чтобы ингибировать регенерацию во время фазы куколки.
Передача сигналов JNK необходима для усиления экспрессии
моль после повреждения тканиУчитывая, что активация моль после повреждения ткани была важна для продукции ROS в регенерирующем эпителии и устойчивой регенеративной передачи сигналов, мы хотели идентифицировать восходящий сигнал, который регулирует экспрессию моль .Мы предположили, что передача сигналов регенерации сама по себе, в частности передача сигналов JNK, может индуцировать повышающую регуляцию моль . Каноническая передача сигналов JNK действует через фактор транскрипции AP-1, который является гетеродимером Jun (FBgn0001291) и Fos (FBgn0001297) [121]. Нижестоящие гены регулируются посредством связывания AP-1 с последовательностью консервативного TPA-чувствительного элемента (TRE) (TGAC / GTCA) [122]. В самом деле, существует три консенсусных сайта TRE в локусе mol : один на 2 т.п.н. выше сайта начала транскрипции, один в первом интроне и один в пятом интроне (рис. 8A).
Рис. 8. Экспрессия моль регулируется передачей сигналов JNK.
(A) Схема локуса mol , показывающая относительные положения трех канонических сайтов TRE. (B, C) Иммуноокрашивание против β-галакозидазы, показывающее экспрессию репортера mol-lacZ (зеленый) в контроле (B) и UAS-JNK DN (C) R24 дисков. (D) Количественная оценка флуоресценции mol-lacZ по иммуноокрашиванию. w 1118 n = 10 дисков, UAS-JNK DN n = 10 дисков.(E) Иммуноокрашивание против β-галакозидазы, показывающее экспрессию репортера mol-lacZ в регенерирующем диске hep r75 / + R24. (F) Количественная оценка флуоресценции mol-lacZ по иммуноокрашиванию. w 1118 n = 7 дисков, hep r75 / + n = 8 дисков. Шкала 100 мкм. Планки погрешностей — SEM. ** p <0,002.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1006937.g008
Чтобы определить степень, в которой передача сигналов JNK необходима для экспрессии моль после повреждения ткани, мы ингибировали передачу сигналов JNK путем экспрессии доминантно-негативного JNK ( UAS-JNK DN ) (FBgn0000229) [123] под контролем rn -GAL4 во время абляции крыльевого мешка. Интересно, что экспрессия репортера mol-lacZ была значительно снижена при снижении передачи сигналов JNK через UAS-JNK DN (рис. 8B-8D), что свидетельствует о том, что передача сигналов JNK важна для активации mol после повреждения ткани. .Чтобы подтвердить это открытие, мы также исследовали экспрессию mol-lacZ в регенерирующих крыльевых дисках, которые были гетерозиготными мутантами по гемиптероз (hep) (FBgn0010303), который кодирует киназу JNK [124]. Экспрессия репортера mol-lacZ также была значительно снижена у самок hep r75 / + регенерирующих крыльевых дисков (рис. 8E и 8F). Таким образом, регуляция экспрессии моль JNK составляет петлю положительной обратной связи, которая поддерживает передачу сигналов JNK.
ROS активирует как JNK, так и p38a (FBgn0015765) в регенерирующем крыловом диске [43]. Чтобы определить, индуцирует ли передача сигналов p38a также петлю положительной обратной связи через моль , мы исследовали экспрессию mol-lacZ в регенерирующих дисках, которые были гетерозиготными мутантами по p38a 1 . Интересно, что уменьшение p38a не влияло на экспрессию mol-lacZ (S8 фиг.). Таким образом, передача сигналов JNK необходима для усиления экспрессии моль после повреждения ткани, что, в свою очередь, необходимо для поддержания продукции ROS в регенерирующем эпителии и поддержания передачи сигналов JNK во время поздней регенерации (рис. 8G).
Discussion
Эта работа идентифицировала новый механизм, который поддерживает передачу сигналов регенерации и гарантирует, что возобновление роста поврежденной ткани продолжается после первоначального всплеска передачи сигналов повреждения. Хотя повышенные уровни ROS поддерживаются в других моделях регенерации, таких как ампутированные плавники рыбок данио и хвосты Xenopus , где они способствуют передаче сигналов и более поздних стадиях регенеративного роста [99,100,102], механизм, с помощью которого поддерживаются повышенные уровни ROS, остается неуловимым.Наша работа позволила понять эту загадку в Drosophila , обнаружив ключевую петлю положительной обратной связи, которая использует JNK-индуцированную активацию фактора созревания Duox, кодируемого моль , для поддержания продукции ROS, передачи сигналов JNK и поздней регенерации. Подобная индуцированная повреждением регуляция фактора созревания Duox может способствовать передаче сигналов долгосрочной регенерации у многих животных. Мы смогли идентифицировать этот механизм посредством создания транскрипционного профиля активно регенерирующей ткани, что стало возможным благодаря нашей генетически индуцированной системе абляции ткани [6] и нашим техническим достижениям, позволяющим изолировать достаточное количество клеток бластемы [41].
Это первый отчет об усилении фактора созревания Duox как ключевого аспекта реакции регенерации. Другие клеточные функции, которые регулируются DUOXA / NIP, были идентифицированы только недавно. Например, DUOXA / NIP влияет на дифференцировку миобластов скелетных мышц мышей [125], выработку гормонов щитовидной железы и развитие мозжечка [126], а также реакцию на бактериальные инфекции в кишечнике мышей [127], а также развитие экзоскелета у мышей. С . elegans [128] и рекрутирование гемоцитов в раны эпидермиса эмбриона Drosophila и нейтрофилов в дыхательные пути мышей [129,130]. Здесь мы описываем роль моль во время регенерации крыльевого диска и показываем, что, хотя моль активируется транскрипционно, уровни Duox не изменяются в соответствии с нашим транскрипционным профилем, что указывает на то, что точная настройка уровней ROS может быть достигнута путем изменения экспрессии. фактора созревания, а не самого фермента.Эта регулирующая стратегия может применяться во многих других случаях, когда АФК действуют как важные сигнальные молекулы.
В дополнение к изменениям транскрипции, наблюдаемым в регуляторах ROS, многие другие изменения в экспрессии генов могут быть объединены с нашим текущим пониманием регенерации тканей для выявления новых и интересных взаимосвязей между генами и сигналами развития и регенерацией тканей. Например, наши данные указывают на подавление рецептора гормона Hr78 в регенерирующей ткани.Экспрессия Hr78 в крыловом диске, по-видимому, обнаруживается в некоторых провенальных регионах (Рис. 3B). Повреждение ткани в крыловом диске приводит к временной потере экспрессии генов клеточной судьбы, в том числе в провенах, во время регенерации [6,94]. Таким образом, Hr78 может быть новым геном судьбы вены крыла, экспрессия которого подавляется вместе с другими известными генами судьбы вены после повреждения ткани.
В качестве дополнительного примера мы наблюдали дифференциальную регуляцию различных генов рецепторов ядерных гормонов, которые транскрипционно регулируются гормоном экдизоном [131].Регенерирующие животные задерживают метаморфоз, чтобы приспособиться к возобновлению роста поврежденной ткани, регулируя передачу сигналов экдизона, которая контролирует переходы в развитии [132]. Мишени экдизона, которые, как мы обнаружили, подавляют регуляцию в регенерирующих крыльевых дисках, включают рецептор гормона 46 ( Hr46 / Hr3 ) (FBgn0000448), рецептор гормона 4 ( Hr4 / CG42527 ) (индуцированный белок FBgn0264562dCysone и ( Eip78C ) (FBgn0004865) (Таблица S2). Интересно, что мы также наблюдаем повышающую регуляцию Cyp18a1 (FBgn0010383), фермента цитохрома P450, который осуществляет регуляцию отрицательной обратной связи на передачу сигналов экдизона путем снижения внутриклеточных уровней экдизона [133].Таким образом, Cyp18a1 может быть активирован, чтобы гарантировать, что передача сигналов экдизона остается низкой в регенерирующей ткани, чтобы усилить контрольную точку развития, вызванную повреждением ткани.
Регенерация включает в себя управление различными клеточными процессами для восстановления и замены поврежденной части тела. Это требует координации пролиферации, роста, формирования паттернов и изменений в архитектуре и движении клеток строго регулируемым образом. Эти драматические изменения могут быть скоординированы ключевыми факторами транскрипции.Несколько факторов транскрипции по-разному экспрессируются в нашем профиле, включая chinmo , Ets21C , AP-2 / TfAP-2 (FBgn0261953), fru , Atf3 / A3 -3, dve и Дирижабль-1 (FBgn0035625). Эти факторы транскрипции могут находиться в центре регуляторных сетей, которые вызывают ключевые клеточные изменения. Например, Ets21C является известной нижестоящей мишенью передачи сигналов JNK при заживлении ран [86] и передачи сигналов EGFR в стволовых клетках кишечника [134], а также необходим в качестве кофактора для фактора транскрипции пути JNK AP-1 в организме человека. регулируют транскрипционные мишени во время образования опухоли [84,85].Т.о., его экспрессия в регенерирующем крыловом диске может быть результатом интеграции множественных сигналов, и его потребность в регенерации может быть обусловлена его ролью в обеспечении экспрессии мишеней JNK. Дальнейшее изучение механизмов этих факторов транскрипции приведет к лучшему пониманию регенерации.
Регенерация — это жестко контролируемый процесс, требующий баланса между положительными и отрицательными регуляторами, чтобы рост стимулировался, но не отменялся. Действительно, наш функциональный анализ продемонстрировал, что несколько генов с повышенной регуляцией, в том числе heartless и Nox , служат для ограничения регенерации, поскольку регенерация улучшается у гетерозиготных мутантных животных.Следовательно, функциональный анализ имеет решающее значение для интерпретации данных об экспрессии генов, поскольку выводы, основанные только на дифференциальной экспрессии, могут вводить в заблуждение. Действительно, именно с помощью функционального анализа мы идентифицировали mol , а не Nox , как критический регулятор, который способствует устойчивой продукции ROS и передаче сигналов JNK, завершая петлю положительной обратной связи, которая поддерживает регенерацию. Дальнейший функциональный анализ дифференциально экспрессируемых генов, вероятно, выявит дополнительные механизмы, контролирующие регенерацию тканей.
Материалы и методы
Система абляции
Абляция ткани проводилась, как описано ранее [6,82], с использованием rnGal4 , UAS-rpr и tubGAL80 ts для регулирования гибели клеток в пространстве и времени с тепловым сдвигом от 18 ° до 30 ° C в течение 24 часов в течение раннего третьего возраста личинки. Для синхронизации развития яйца собирали в течение четырех часов на чашках для виноградного сока, личинок первого возраста собирали вскоре после вылупления через два дня после кладки яиц и переносили во флаконы, а флаконы подвергали термическому сдвигу через 7 дней после кладки яиц, что была определена сразу после линьки путем подсчета крючков для рта.
Fly lines
Мух выращивали на стандартной мелассовой среде при 25 ° C, за исключением экспериментов по регенерации. Следующие линии Drosophila были получены из Bloomington Stock Center или были подарками, как указано: w 1118 ; rnGAL4 , UAS-rpr , tubGAL80 ts / TM6B , tubGAL80 и w 1118 ; rnGAL4 , tubGAL80 ts / TM6B [6], w 1118 ; y 1 , w *; Mi {MIC} nub MI05126 (BL37920) [48], y 1 , w 67c23 ; P {lacW} chinmo k13009 / CyO (BL10440) [135], y 1 , w * Mi {MIC} свиньи MI11007 (485627 95627 MI1100727 ],
P {PZ} Alp4 07028 , ry 506 (BL12285) [135], w 1118 ; PBac {Ets21C-GFP . FLAG} VK00033 / TM3 , Sb 1 (BL38639), P {PZ} osp 00865 ; ry 506 P {PZ} zfh2 00856 / TM3 , ry RK Sb 963 Sb Sb 1 ) [136], y 1 w 67c23 ; P {lacW} mol k11524a / CyO (BL12173) [135], ry 506 P {PZ} fru 3 135], w ;; pBAC [atf3 :: EGFP] / TM6B (подарок М.Улирова) [137], nlaZ : GFP [R2] (подарок М. Ганфорниной) [69], w 1118 ; P {10xStat92E-GFP} 1 (BL26197) [66], cn 1 P {PZ} dve 01738 / CyO; ry 506 (BL11073) [135], cn 1 P {PZ} sm 05338 / CyO; ry 506 (BL11403) [78], y 1 w *; P {PTT-GB} LamC CB04957 ttv CB04957 / SM6a (BL51528) [138], y 1 9 *0008; Ми {PT-GFSTF . 1} AdoR MI01202-GFSTF . 1 / TM6C , Sb 1 Tb 1 (BL60165) [139], y 1 w P {lacW} Thor k13517 (BL9558) [67], y 1 w *; Ми {PT-GFSTF . 0} Кей MI05333-GFSTF . 0 (BL63175) [139], w 1118 ; PBac {corto-GFP . FPTB} VK00037 (BL42268), w 1118 ; PBac {Hr78-GFP . FLAG} VK00037 (BL38653), w 1118 ; PBac {NC2β-GFP . FPTB} VK00033 (BL56157), y 1 w *; Mi {PT-GFSTF.0} Cat MIO4522-GFSTF.0 (BL60212) [139], Hml Δ RFP (подарок К. Брукнера) [115], TRE-красный и gstD- GFP (подарки Д.Bohmann) [114], Ets21C f0369 (BL18678) [140], y 1 w *; Mi {MIC} CG9336 MI03849 (BL36397) [139], y 1 w 67c23 ; P {lacW} Col4a1 K00405 / CyO (BL10479) [135], y 1 w 67c23 ; P {lacW} vkg k00236 (BL10473) [135], P {PZ} Thor 06270 cn 1 / CyO; ry 506 (BL11481) [141], w 1 ; П {UAS-Sod1 . A} B36 (BL24754), w 1 ; P {UAS-CatA} 2 (BL24621), w 1 ; П {UAS-Sod2 . M} UM83 (BL24494), w 1118 ; PBac {RB} mol e02670 / CyO (BL18073) [140], y 1 sc * v 1 909; П {TRiP . HMS02560} attP40 (UAS-mol RNAi ) (BL42867), y 1 v 1 ; П {TRiP . GL00678} attP40 ( UAS — Duox RNAi ) (BL38907), y 1 v 1 ; П {TRIP . GL00678} attP40 (UAS — Nox RNAi ) (BL32902), y 1 w *; Mi {MIC} Nox MI15634 / SM6a (BL61114) [139], puc E69 [53], UAS — JNK 9000, DNK 9000, DN
w * hep r75 / FM7C (BL6761) [124], w *; P {neoFRT} 82B p38a 1 (BL8822) [143].
Иммуногистохимия и микроскопия
Иммуноокрашивание проводили, как описано ранее [6].
Антитела и использованные разведения: антитела против Nubbin (1: 500) (подарок S. Cohen) [47], мышиные антитела против βgal (1: 100) (DSHB; 40-1a-s), кроличьи анти-βgal (1 : 500) (MP Biomedicals), мышиные анти-GFP (1:10) (DSHB 12E6), кроличьи антитела против Myc (1: 500) (Santa Cruz Biotech d1-717 sc-28207), кроличьи антитела против Ph4 (1: 500) (Millipore), мышиный анти-Нимрод (1: 1000) (подарок И. Андо) [116] и анти-Твист (1: 200) (подарок А.Статопулос) [144].
Вторичные антителаAlexa Fluor (AF) от Molecular Probes были AF488, AF555 и AF633 (использовались в соотношении 1: 500). Ядра метили DAPI (Sigma) (1: 5000).
ВключениеEdU осуществляли с использованием набора Click-it EdU Alexa Fluor 594 Imaging (молекулярные зонды), как описано ранее [145]. Образцы были смонтированы в Vectashield (Vector Labs).
Образцы с иммуноокрашенными изображениямиполучали на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 700, а изображения обрабатывали с помощью программ ZenLite, Adobe Photoshop и Image J.Визуализация крыльев взрослых особей в светлом поле проводилась на микроскопе Olympus SZX10 с использованием программного обеспечения CellSens Dimension, а изображения обрабатывались с использованием Image J.
Обнаружение ROS
АФК были обнаружены в имагинальных дисках с использованием дигидроэтидия (DHE) (D11347, Molecular Probes) с использованием протокола, описанного в Owusu-Ansah et al. [146], с небольшими изменениями. Вкратце, личинки препарировали в среде Шнайдера (SM). DHE восстанавливали в ДМСО, а затем добавляли к SM в концентрации 30 нМ.Образцы инкубировали в этом растворе DHE в течение 5 минут (мин) на шейкере с последующими тремя быстрыми промываниями в SM. Затем образцы фиксировали в 7% параформальдегиде, приготовленном в 1Х фосфатном буферном солевом растворе (PBS), в течение 7 минут. Образцы промывали один раз в 1X PBS, и имагинальные диски немедленно вырезали для установки в Vectashield с помощью DAPI. Образцы сразу же отображались на конфокале, чтобы избежать окисления DHE окружающей средой.
Количественная оценка данных и статистический анализ
Анализ интенсивности флуоресценции проводили с использованием отдельных конфокальных срезов.Средняя интенсивность была рассчитана путем измерения значений интенсивности в трех прямоугольниках одинакового размера в области мешочка крылового диска на изображении J, за исключением gstD-GFP , экспрессия которого не была однородной и, таким образом, была определена количественно путем измерения интенсивности GFP в вся область мешочка. Средние значения интенсивности дисков с несколькими крыльями были объединены для расчета окончательной средней интенсивности, нанесенной на графики. Для измерения площади мешочка была взята максимальная проекция всех конфокальных срезов, а площадь, экспрессирующая нуббин, была измерена на изображении J.Графики построены в Excel, R и GraphPad Prism 7.0.
Для измерения имагинального диска и количественной оценки иммунофлуоресценции использовали t-критерий Велча с использованием R и GraphPad Prism 7.0. Для анализа размера крыла взрослых животных были выполнены тесты хи-квадрат с использованием онлайн-инструментов GraphPad. Статистический анализ измерений крыла взрослых особей проводился с использованием t-критерия Велча.
Выделение клеток бластемы и получение библиотеки РНК
Аблированные регенерирующие диски имели генотип nub-GFP / +; rn-Gal4 , GAL80 ts , UAS-rpr / + , тогда как контроли с имитацией абляции имели генотип nub-GFP / +; рН-Gal4 , GAL80 тс / + .Клетки выделяли для определения транскрипционного профиля, как описано ранее [41]. Вкратце, диски были препарированы с использованием групп из 4 исследователей, анализирующих одновременно, чтобы максимизировать количество дисков, полученных на образец. TrypLE Select (Life Technologies) использовали для достижения быстрой диссоциации дисковых клеток. Клетки GFP + были отсортированы с помощью FACS. мРНК из выделенных клеток получали с использованием набора RNeasy Mini Kit (# 74104, Qiagen). Несколько дней препарирования и подготовки РНК были объединены таким образом, что каждая биологическая копия состояла примерно из 600 регенерирующих имагинальных дисков, 86000 клеток GFP + и до 900 нг РНК.Неповрежденные контроли состояли из 120 дисков на реплику, которые продуцировали приблизительно 106 500 клеток GFP + и 1000 нг РНК. Правильность сортировки была подтверждена ранее [41]. Качество РНК подтверждалось с помощью биоанализатора (Agilent 2100). Создание библиотеки осуществлялось с использованием набора TruSeq Stranded RNA Sample Prep от Illumina. Секвенирование проводили на HiSeq2000 с использованием набора для секвенирования TruSeq SBS версии 3. Биотехнологический центр им. Роя Дж. Карвера при Университете Иллинойса в Урбане-Шампейне выполнил подготовку библиотеки и секвенирование.
Биоинформатика
чтения Fastq были обрезаны с помощью FASTQ Quality Trimmer (v.1.0.0), а последовательности адаптеров были удалены с помощью Clip (v.1.0.1) в Galaxy [147]. Считывания были согласованы с помощью Tophat2 (v.0.6) [51,52] по геному Drosophila melanogaster (NCBI, сборка 5.41) с максимально допустимыми двумя несоответствиями. Длина интрона составляла от 20 до 150 000, а модель гена была предоставлена как GTF (NCBI, сборка 5.41). Оценка FPKM проводилась с использованием Cufflinks (v.0.0.7) [51], и были выполнены как коррекция смещения, так и коррекция множественного чтения. Анализ дифференциальной экспрессии был выполнен с использованием Cuffdiff [51], была проведена нормализация геометрической библиотеки, и уровень ложного обнаружения был установлен на 0,05. Кроме того, выровненные чтения были подсчитаны с помощью HTSeq (v.0.3.2) [51]. Весь биоинформатический анализ проводился с использованием пакета Galaxy [147]. Данные, обсуждаемые в этой публикации, были депонированы в NCBI’s Gene Expression Omnibus [148] и доступны через регистрационный номер серии GEO GSE101797 (https: // www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE101797).
Вспомогательная информация
S1 Рис. Характеристики системы абляции диска крыла.
( A) Изменение размера крыльевого мешка по данным иммуноокрашивания против нубов в неповрежденных и удаленных крыльевых дисках. Обратите внимание на минимальные различия в размере мешка при R0, что указывает на стабильность абляции. Неповрежденных n = 8, регенерация n = 28. Планки ошибок — SEM. (B) Количественная оценка процента регенерирующих животных, которые окукливались каждый день, показывая асинхронное развитие окукливания, которое произошло после повреждения ткани.Неповрежденными животными были w 1118 ;; rnGAL4 , Gal80 TS / + , регенерирующие животные были w 1118 ;; rnGAL4 , UAS-reaper , Gal80 TS / + , и оба испытали 24-часовой температурный сдвиг. Три независимых эксперимента, всего неповрежденных n = 144 куколок, регенерирующих n = 176 куколок. (C) Процент крыльев разных размеров на w 1118 ;; rnGAL4 , UAS-reaper , Gal80 TS / + животных, вылупившихся в разные дни после откладки яиц из-за асинхронного развития, вызванного повреждением тканей.Обратите внимание, что у животных, которые замкнулись первыми (18-й день), крылья были меньше, чем у тех, которые замкнулись на 19-й день, а у животных, которые замкнулись на 20-й день, были самые большие крылья. Таким образом, изменение размера крыла после регенерации диска частично определяется продолжительностью времени регенерации. Три независимых эксперимента, всего n = 371 крыло.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.s001
(TIF)
S2 Рис. Дифференциально экспрессируемые гены, обнаруженные в более чем одном профиле транскрипции регенерации крыльевого диска.
(A) Диаграммы Венна, показывающие, что гены, по крайней мере, в 1,3 раза активированы или подавлены в трех профилях транскрипции (эта работа, [39,40]) регенерирующих крыльевых дисков, созданных с использованием различных методов. Обратите внимание, что количество генов из Blanco et al. исследование является недостаточным, поскольку не был опубликован полный список идентифицированных дифференциально экспрессируемых генов. (B) Списки дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ), общих между этим исследованием и каждым предыдущим исследованием, а также кратное изменение в этом исследовании.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.s002
(TIF)
S3 Рис. Дополнительные репортеры, протестированные на дифференциальную экспрессию и проверку qPCR.
Неповрежденные (A-G) и восстанавливающиеся (R24) (A’-G ’) диски крыльев. (A-A ’) AdoR-GFP Ловушка энхансера MiMIC. (B-B ’) Белковая ловушка Kayak-GFP. (C-C ’) Ловушка энхансера Thor-lacZ . (D-D ’) Белковая ловушка Corto-GFP. (E-E ’) NLaz-GFP Ловушка энхансера MiMIC. (F-F ’) анти-Твист. (G-G ’) энхансерная ловушка zfh2-lacZ .Синяя пунктирная линия очерчивает зачаток крыла. Шкала 100 мкм. (H) Количественная оценка усиления экспрессии моль , Nox и Ets21C с помощью кПЦР. Каждая из четырех биологических копий. Планки погрешностей — SEM, * p <0,05.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.s003
(TIF)
S4 Рис. Некоторые активированные гены ограничивают регенерацию.
(A) Взрослые fru 3 / + самцы после регенерации имели крылья большего размера, чем контроли.Три независимых эксперимента, w 1118 n = 112 крыльев, fru 3 / + n = 95 крыльев, p <0,001 по критерию хи-квадрат. (B) Взрослые htl AB42 / + животные после регенерации имели крылья большего размера, чем контрольные. Три независимых эксперимента, w 1118 n = 316 крыльев, htl AB42 / + n = 223 крыла, p <0.001 по критерию хи-квадрат. Планки погрешностей - SEM.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.s004
(TIF)
S5 Рис. Гемоциты связаны только с несколькими поврежденными дисками.
( A-D) Hemolectin-RFP (Hml-RFP) (зеленый) показывает гемоциты рядом с неповрежденными (A, B) и R24 (C, D) крыльевыми дисками. (E, F) Anti-Nimrod (зеленый) также показывает гемоциты около крылового диска R24, подтверждая результаты Hml-RFP. (B), (D) и (F) — ортогональные срезы с столбчатым эпителием или собственно диском (DP) в нижней части и периподиальным эпителием (PE) в верхней части изображений.(G) Схема неповрежденного и регенерирующего эпителия, показывающая расположение гемоцита за пределами PE.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.s005
(TIF)
S6 Рис.
моль требуется для экспрессии гена поздней регенерации.(A) Экспрессия molRNAi вызвала меньшие крылья взрослых особей после регенерации имагинальных дисков, чем контроли. Три независимых эксперимента, w 1118 n = 402 крыла, UAS-molRNAi n = 221 крыло, p <0.0001 по критерию хи-квадрат. (B-C) Клеточный мусор визуально отличается от регенерирующего эпителия. Регенерация w 1118 (B) и mol e02670 / + (C) дисков при R24, экспрессия nub-GFP энхансера, улавливающая и окрашенная DHE. Крапчатая зернистая ткань GFP — это клеточный мусор, обведенный желтым. Гладкая ткань GFP — это интактный эпителий, выделенный синим цветом. На боковых панелях увеличено изображение обломков и эпителия, чтобы показать, что они легко различимы.(D, E) Неповрежденные и R24 w 1118 диски, окрашенные DAPI и детектором ROS H 2 DCFDA. (FJ) экспрессия gstD-GFP в неповрежденном w 1118 (F) и регенерация w 1118 (G, H) и моль e02670 (I, J) диски крыльев на R24 (G, I) и R48 (H, J). (KO) Иммуноокрашивание Anti-Myc в w 1118 (K, L) и моль e02670 / + (M, N) регенерирующие диски крыльев при R24 (K, M) и R48 (L, N).(O) Количественная оценка иммунофлуоресценции при окрашивании Myc. R24 w 1118 n = 14 дисков, моль e02670 / + n = 12 дисков. R48 w 1118 n = 11 дисков, моль e02670 / + n = 14 дисков. Шкала 100 мкм. Планки погрешностей — это SEM, если не указано иное. * р <0,02.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.s006
(TIF)
S7 Рис.Влияние снижения уровней DUOX и NOX на регенерацию.
Анализ регенерации с использованием размера крыла взрослой особи для оценки степени регенеративного роста имагинальных дисков. (A) Размеры взрослых крыльев после регенерации диска у w 1118 и UAS-DuoxRNAi животных. Три независимых эксперимента. w 1118 n = 390 крыльев, UAS-DuoxRNAi n = 200 крыльев, p = 0,0005 с использованием критерия хи-квадрат. (B) Размеры взрослых крыльев после регенерации диска у w 1118 и UAS-NoxRNAi животных.Два независимых эксперимента, таким образом, погрешности — стандартное отклонение. w 1118 n = 299 крыльев, UAS-NoxRNAi n = 257 крыльев, p <0,0001 с использованием критерия хи-квадрат. (C) Размеры взрослых крыльев после регенерации диска у w 1118 и Nox MI15634 / + животных. Три независимых эксперимента. w 1118 n = 349 крыльев, Nox MI15634 / + n = 180 крыльев, p <0.0001 с использованием критерия хи-квадрат. (D, E) КПЦР, демонстрирующая эффективность РНКи Duox (D) и Nox (E). РНКи экспрессировалась под контролем rn-GAL4 в мешочке нормально развивающихся крыльевых дисков в течение 24 часов перед сбором для количественной ПЦР. Каждая из трех биологических повторов, * p <0,05. (F) Общее количество митотических клеток, идентифицированное окрашиванием анти-фосфо-гистоном h4 в крыльевом мешочке, определенное окрашиванием анти-Nub в указанных генотипах. R0 w 1118 n = 14 дисков, Nox MI15634 / + n = 15 дисков, UAS-NoxRNAi n = 15 дисков, R24 963 964 964 n = 12 дисков, Nox MI15634 / + n = 17 дисков, UAS-NoxRNAi n = 15 дисков, R48 w 1118 n = 11 дисков 963 MI15634 / + n = 18 дисков, UAS-NoxRNAi n = 19 дисков.(G) Площадь крыльевого мешочка, отмеченная окрашиванием против Nub, измеряли при R0, R24 и R48 для указанных генотипов. R0 w 1118 n = 14 дисков, Nox MI15634 / + n = 15 дисков, UAS-NoxRNAi n = 15 дисков, R24 963 964 964 n = 12 дисков, Nox MI15634 / + n = 17 дисков, UAS-NoxRNAi n = 15 дисков, R48 w 1118 n = 11 дисков 963 MI15634 / + n = 18 дисков, UAS-NoxRNAi n = 19 дисков.(H) Время окукливания для регенерирующих животных указанных гентоипов. Три независимых эксперимента. w 1118 n = 204, Nox MI15634 / + n = 113, UAS-NoxRNAi n = 206 (I) Сроки окукливания у нормально развивающихся животных, у которых не было термический сдвиг и, таким образом, не приводил к абляции и регенерации зачатков крыла. Обратите внимание, что, поскольку эти животные не испытали теплового сдвига, время окукливания нельзя сравнивать напрямую со временем окукливания на панели H, где животные действительно испытали тепловой сдвиг. w 1118 n = 97, Nox MI15634 / + n = 49, UAS-NoxRNAi n = 122. Полосы ошибок — SEM.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.s007
(TIF)
S8 Fig.
Экспрессия mol не регулируется p38a.(AE) Иммуноокрашивание против β-галакозидазы, показывающее экспрессию репортера mol-lacZ (зеленый) в w 1118 неповрежденных дисках (A) и в регенерирующих дисках крыльев в R0 (B), R24 (C) и R48 (D).(E) Количественная оценка изменений экспрессии mol-lacZ . Неповрежденные n = 3, R0 n = 7, R24 n = 10, R48 n = 10. ( F, G) Иммуноокрашивание против β-галакозидазы, показывающее экспрессию репортера mol-lacZ (зеленый) в w 1118 (F) и p38a 1 / + (G) R24 диски. (H) Количественная оценка флуоресценции при иммуноокрашивании. Два независимых эксперимента, всего w 1118 n = 10 дисков, p38a 1 / + n = 12 дисков.Шкала 100 мкм. Планки погрешностей — SEM.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006937.s008
(TIF)
IJMS | Бесплатный полнотекстовый | МикроРНК: ключевые регуляторы в центральной нервной системе и их значение при неврологических заболеваниях
Было показано, что эпигенетические изменения, включая метилирование ДНК и модификацию гистонов, играют важную роль во время развития мозга [54,55]. Новые данные показывают, что эпигенетические изменения и регуляция miRNA взаимосвязаны друг с другом, что делает регуляторную сеть генов в ЦНС более сложной и устойчивой.Метилирование ДНК и модификация гистонов могут прямо или косвенно регулировать экспрессию miRNA в ненейрональной системе. В линиях клеток, нокаутированных по ДНК-метилтрансферазам, регулировалась экспрессия около 10% miRNAs [56]. Сходным образом обработка ингибитором гистондеацетилазы (HDAC) в клеточной линии изменяет экспрессию субнабора miRNAs [57]. Обработка как агентом деметилирования ДНК, так и ингибитором HDAC вызвала изменения экспрессии miRNA в клетках рака мочевого пузыря [58]. В свою очередь, miRNA могут также регулировать метилирование ДНК и модификацию гистонов.Например, сообщалось, что члены DNMT нацелены на miRNA: miR-29 нацелена на DNMT3a / 3b [59], miR-199a-3p нацелена на DNMT3a [60] и miR-148 нацелена на DNMT3b [61] посредством связывания с их 3 ‘-UTR или кодирующая область. Более того, было продемонстрировано, что miR-449a непосредственно подавляет регуляцию HDAC-1. Это перекрестное взаимодействие между miRNA и эпигенетикой также существует в ЦНС. В 2010 году Szulwach et al. изучили перекрестные помехи между miR-137, MeCP2 и Ezh3 [62]. MeCP2 является членом семейства ДНК-метил-CpG-связывающих белков (MBD) [63].Он необходим для нормального функционирования нервных клеток и участвует в ряде заболеваний [64]. Мутация de novo MeCP2 вызывает синдром Ретта [65], в то время как избыточная экспрессия MeCP2 в мозге обезьяны приводит к аутистическому поведению [66]. В нервных стволовых клетках мышей (NSCs) с дефицитом Mecp2 была идентифицирована измененная экспрессия miRNA, среди которых miR-137 была дополнительно изучена [62]. miR-137, как было показано, является важным модулятором в нейрогенезе взрослых, и было установлено, что экспрессия miR-137 эпигенетически регулируется MeCP2 посредством изменения эпигенетического статуса в хроматине, окружающем miR-137, что приводит к преждевременной экспрессии miR-137 [62] .Более того, miR-137 функционально нацелена на Ezh3, гистон-метилтрансферазу и член семейства белков PcG [62]. Такое подавление Ezh3 вызывает общее снижение триметилирования h4K27 [62]. Другое исследование, опубликованное в 2010 г., предоставило дополнительные доказательства перекрестной связи между miRNA и эпигенетикой [67]. В этом исследовании miR-184 была идентифицирована как микроРНК, функционирующая для регулирования баланса между пролиферацией и дифференцировкой нервных стволовых клеток путем воздействия на Numblike, известный регулятор развития мозга.Интересно, что miR-184 регулируется с помощью MBD1, эпигенетического репрессора транскрипции. В совокупности коммуникация между miRNA и эпигенетикой выявляет более обширную регуляторную сеть в ЦНС. Будет жизненно важно продолжить изучение того, как они взаимодействуют друг с другом в нормальной физиологии ЦНС и в патогенезе неврологических заболеваний.Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Структурная основа, лежащая в основе сильных взаимодействий между анкиринами и спектринами
Abstract
Анкирины (кодируются ANK1 / 2/3 , соответствующими Ankyrin-R / B / G или AnkR / B / G), через связывание со спектринами, связывают плазму мембраны с актиновым цитоскелетом для поддержания механической прочности и модуляции возбудимости различных клеток, таких как нейроны, мышечные клетки и эритроциты.Клеточные и генетические данные предполагают, что каждая изоформа анкиринов соединяется со специфическим β-спектрином в дискретных субклеточных микродоменах мембраны для выполнения различных функций, хотя молекулярные механизмы, лежащие в основе таких пар анкирин / β-спектрин, неизвестны. В этом исследовании мы обнаружили, что консервативный и короткий удлиненный N-конец тандема ZU5 N -ZU5 C -UPA (exZZU) имеет решающее значение для связывания каждого анкирина с β-спектринами с высоким сродством. Структуры AnkB / G exZZU в комплексе со спектриновыми повторами 13-15 β2 / β4-спектринов, решенные здесь, показывают, что последовательность удлинения exZZU образует дополнительную β-цепь, способствующую структурной стабильности и повышенному сродству каждого ZU5 N / спектрина. повторить взаимодействие.Сайт соединения между удлинением и ZU5 N является точно позицией сайта вставки опосредованного сплайсингом миниексона AnkB / G. Сложные структуры также показывают, что UPA-домен exZZU непосредственно участвует в связывании спектрина. Формирование супрамодуля exZZU сопоставляет домены ZU5 N и UPA для одновременного взаимодействия со спектриновыми повторами 14 и 15. Однако наши биохимические и структурные исследования показывают, что прямые и сильные взаимодействия между анкиринами и β-спектринами, по-видимому, не определяют их особенности спаривания.Следовательно, вероятно, существует дополнительный механизм (ы) для модуляции функциональных пар между анкиринами и β-спектринами в клетках.
Введение
Анкирины и спектрины являются ключевыми каркасными белками в мембранных доменах микронного масштаба возбудимых и механорезистентных тканей / клеток, таких как Т-канальцы сердца в кардиомиоцитах, начальный сегмент аксона (AIS) и узлы Ранвье ( NOR) в нейронах, латеральная мембрана в эпителиальных клетках, саркомеры в скелетных мышцах и плазматическая мембрана в эритроцитах [1–3].Эти специализированные мембранные домены сгруппированы с высокой плотностью ионных каналов, молекул клеточной адгезии и различных сигнальных белков для достижения своих высокоспециализированных функций. Закрепляя и стабилизируя многочисленные интегральные мембранные белки на определенных участках мембраны, комплексы анкирина и спектрина связывают эти интегральные мембранные белки с сетями цитоскелета на основе спектрина / актина, помогая организовать и поддерживать эти мембранные микродомены. Нарушения функций комплексов анкирин / спектрин приводят к сбоям в работе микродоменов мембран и вызывают множество различных типов заболеваний человека.Например, известно, что ряд мутаций потери функции в анкирин-R (AnkR) и β1-спектрине вызывают наследственный сфероцитоз [4–6]; генетические варианты анкирина-G (AnkG) и анкирина-B (AnkB) связаны с биполярными расстройствами [7–11], шизофренией [12–14], расстройствами аутистического спектра [15–22] и тяжелой атаксией [23]; мутации в β3-спектрине вызывают спиноцеребеллярную атаксию 5 типа (SCA5) [24–26]; изменения в β4-спектрине вызывают спектринопатию [27–29]; дисфункция AnkB или β2-спектрина может привести к серьезным сердечным патологиям, таким как наследственная аритмия сердца, известная как синдром AnkB [30–37].
Семейство Ankyrin состоит из трех членов, AnkR, AnkB и AnkG, которые кодируются ANK1 , ANK2 и ANK 3 соответственно. Все три анкирина имеют сходные доменные организации (рис. 1A): мембранно-связывающий домен (MBD), расположенный на N-конце, ответственный за взаимодействие с различными мембранными белками [38], спектринсвязывающий домен (SBD), следующий за MBD, линкерная область, соединяющая MBD и SBD, которые также способны сворачиваться, чтобы ингибировать взаимодействия MBD / мишень [39], неструктурированный хвост, следующий за SBD с чрезвычайно разной длиной, за которым следует домен смерти, и короткий C-концевой домен.SBD состоит из трех субдоменов, ZU5 N , ZU5 C и домена UPA, образующих структурный супрамодуль (ZZU) [40]. Семейство Spectrin состоит из двух групп субъединиц: α-спектринов и β-спектринов, каждая из которых содержит несколько непрерывных повторов спектрина. Под плазматической мембраной живых клеток спектрины существуют в виде тетрамеров, каждый из которых образован двумя α и двумя β субъединицами. Позвоночные животные экспрессируют два α-спектрина (αI, αII) и пять β-спектринов (β1, β2, β3, β4 и β5). Их спектринные повторы наделяют тетрамеры спектрина механической стойкостью [41–44].За исключением β5-спектрина, все β-спектрины млекопитающих могут связываться с анкиринами через их средние спектриновые повторы [1,45].
Рисунок 1: Консервативная последовательность удлинения требуется для сильных взаимодействий анкирин / β-спектрин(A) Схематическая диаграмма, показывающая доменные организации AnkR / B / G.
(B) Выравнивание аминокислотной последовательности, показывающее консервативную последовательность удлинения с N-конца по отношению к ZU5 N среди AnkR мыши, AnkB человека и AnkG крысы. «*», «:»и «.» указывают на полностью консервативные, высококонсервативные и консервативные остатки соответственно.
(C) Результаты ITC, показывающие, что связывание AnkB exZZU с β2-спектрином R13-15 более чем в 20 раз сильнее, чем AnkB ZZUD без удлинения.
(D) Результаты ITC, показывающие, что связывание AnkG exZZUD с β2-спектрином R13-16 более чем в 10 раз сильнее, чем AnkG ZZUD без расширения
Ряд доказательств подразумевает, что изоформы анкирина и спектрина могут иметь специфичность попарного связывания в различных субклеточных микродомены. Например, AnkG специфически спаривается с β2-спектрином в латеральных мембранах эпителиальных клеток; AnkB образует комплекс с β2-спектрином по всем аксонам нейронов, тогда как AnkG спаривается специфически с β4-спектрином в AIS и NOR в аксонах [2].Другое интересное наблюдение состоит в том, что когда AnkG был нокаутирован из аксона, AnkR вместе с β1-спектрином вместо β4-спектрина стал обогащаться NOR [46]. В свою очередь, пара β1-спектрин / AnkR вместо комплекса β1-спектрин / AnkG стала кластеризоваться в NOR после удаления β4-спектрина из нейронов [46,47]. Эти наблюдения предполагают возможное существование специфических пар между изоформами анкиринов и спектринов в живых клетках, хотя с полностью неизвестными лежащими в основе молекулярными механизмами.
Спектрины вместе с F-актином и некоторыми ассоциированными с актином белками, такими как аддуцин, образуют эластичную сеть цитоскелета вблизи внутренней поверхности плазматических мембран. Анкирины связываются с интегральными мембранными белками (например, анионообменником, L1CAM или E-кадгерином) через свои MBD и связываются с β-спектринами через свои SBD, чтобы соединить плазматические мембраны с эластичным цитоскелетом, тем самым укрепляя липидные бислои мембран для обеспечения механической стабильности. Интересно, что за исключением взаимодействий анкирин / спектрин, аффинности парного связывания между ключевыми компонентами в этой сети все довольно сильны с константами диссоциации (Kd, или половина максимальной концентрации) в несколько десятков наномолей (Рисунок S1).Например, половина максимальной концентрации взаимодействия спектрин / актин составляет ~ 15-75 нМ [48], взаимодействие спектрин / аддуцин составляет ~ 80-100 нМ [49,50], ~ 60 нМ для аддуцина и F-актина кончика. взаимодействия [48] и ~ 10 нМ между α и β-спектрином [51]. Кроме того, на границе мембрана-цитоскелет значения Kd комплекса анкирин / анионообменник составляют ~ 10 нМ [1], а анкирин / нейрофасцин — ~ 50-500 нМ [1,39]. Эти сильные взаимодействия предположительно соответствуют сильной механостабильности анкирина и сборки цитоскелета спектрин / актин в микродоменах мембран.Любопытно, что сообщаемое сродство связывания между анкирином и спектрином составляет ~ 6,8 мкМ [40], что намного слабее, чем у остальных взаимодействий в сети. Принимая во внимание, что взаимодействие анкирин-спектрин является основным связующим звеном между плазматическими мембранами и актиновым цитоскелетом этой сети, сообщаемое слабое сродство между анкирином и спектрином может не поддерживать стабильность сети. Таким образом, мы предположили, что либо указанное сродство к взаимодействию анкирин / спектрин является неполным, либо существуют определенные неохарактеризованные механизмы регуляции взаимодействий анкирин-спектрин.
Хотя тандем анкирина ZU5 N -ZU5 C -UPA (ZZU) образует компактный супрамодуль [40], для связывания анкиринов со спектринами, по-видимому, требуется только первый домен ZU5 (ZU5 N ) тандем [52,53]. Здесь мы обнаружили, что последовательность удлинения, предшествующая ZU5 N тандема ZZU анкиринов, может значительно повысить их аффинность связывания со спектрином. Мы решили кристаллические структуры AnkB exZZU в комплексе с повторами 13-15 (R13-15) β4-спектрина и AnkG exZZU в комплексе с R13-15 β2-спектрина и с R13-15 β4-спектрином.Эти структуры проливают свет на то, как последовательность удлинения в exZZU может усиливать взаимодействия между анкиринами и спектринами. Наши структуры также показывают, что, помимо домена ZU5 N , домен UPA в супрамодуле exZZU анкиринов также напрямую контактирует со спектринами. Биохимические и структурные результаты, представленные в этом исследовании, могут служить основой для понимания конкретных функциональных пар между анкиринами и спектринами в живых клетках.
Результаты
Короткое удлинение N-конца к ZU5
N усиливает взаимодействия анкирин / спектринАнализ аминокислотной последовательности обнаружил, что короткий участок остатков, непосредственно предшествующий домену анкиринов ZU5 N , является высококонсервативным в процессе эволюции и очень похожи между AnkR / B / G (рис. 1A и 1B).Поскольку остатки сразу после этого удлинения (т.е. цепь β1 ZU5 N ) непосредственно участвуют в связывании со спектринами на основе структуры AnkR ZU5 N в комплексе с R13-15 β1-спектрина [52] ( PDB ID: 3KBT; рисунок 1B), мы предположили, что это расширение может участвовать в связывании анкиринов со спектринами. Как и в живых клетках, β2-спектрин может связываться как с AnkB, так и с AnkG [2], поэтому мы выбрали β2-спектрин в качестве репрезентативного β-спектрина для проверки нашей гипотезы.Интересно отметить, что с этой последовательностью удлинения (15 аминокислотных остатков, обведенных розовым цветом на рис. 1A и B), присоединенной к AnkB ZU5 N -ZU5 C -UPA (определенному как exZZU, aa 951-1443), аффинность связывания между β2-спектрином и AnkB exZZU (Kd ~ 0,20 мкМ) более чем в 20 раз сильнее, чем между β2-спектрином и тандемом AnkB ZU5 N -ZU5 C -UPA-DD (ZZUD) (aa 966-1535) (значения Kd ~ 0,20 мкМ против ~ 4,9 мкМ; рисунок 1С). Включение дополнительной N-концевой последовательности, а также домена смерти (т.е.е., фрагмент AnkB, содержащий аминокислотные остатки 930-1535) не увеличивал дополнительно сродство AnkB к β2-спектрину (фигура S2A), предполагая, что этого модуля exZZU достаточно для достижения прочного связывания между AnkB и β2-спектрином. Точно так же включение этого расширения также усилило связывание AnkB с β4-спектрином (рис. S2B) и связывание AnkG с β2-спектрином (рис. 1D). Мы также исследовали роль удлинительной последовательности в связывании AnkB с β1-спектрином. Хотя известно, что AnkB не соединяется с β1-спектрином в живых клетках, последовательность удлинения также усиливает связывание между AnkB и β1-спектрином примерно в 12 раз (рисунок S2C).Взятые вместе, вышеуказанные биохимические исследования показали, что N-концевая последовательность удлинения ZU5 N может усиливать попарные связывания между анкиринами и β-спектринами. Важно отметить, что значения Kd между анкиринами и β-спектринами находятся в диапазоне от десятков до сотен наномолей, что соответствует остальным сильным парным взаимодействиям в сетях цитоскелета анкирин / актин, показанных на рисунке S1. Наши результаты также показали, что взаимодействия между различными комбинациями пар анкирина и β-спектрина, по-видимому, являются сильными взаимодействиями (т.е. отсутствует код парной специфичности между конкретными парами анкиринов и β-спектринов, наблюдаемых в клетках).
Кристаллическая структура комплекса β2-спектрин / AnkG exZZU
Для выяснения подробных механизмов, лежащих в основе опосредованного N-концевым удлинением усиления взаимодействий между анкиринами и β-спектринами, мы сначала кристаллизовали β2-спектринные повторы 13-15 в комплексе с AnkG exZZU (а.о. 975-1465) и решил сложную кристаллическую структуру с разрешением 3,3 Å (таблица 1).В соответствии с апоформной структурой тандема AnkB ZU5 N -ZU5 C -UPA [40], тандем AnkG ZU5 N -ZU5 C -UPA также образует супрамодуль с архитектурой типа клеверного листа (рис. 2A), предполагая, что образование супрамодуля ZZU является общей чертой, присущей всем трем членам семейства ankyrin. R13-R15 повторяет контакты β2-спектрина с поверхностями ZU5 N и УПА. Интерфейс между β2-спектрином R14 и AnkG ZU5 N почти идентичен интерфейсу между β1-спектрином R14 и AnkR ZU5 N , как показано в структуре β1-спектрина R13-15 в комплексе с одиночным ZU5 N . AnkR (Рисунок S3) [52].Хотя супрамодуль ZZU обеспечивает больший интерфейс связывания спектрина, R13 β2-спектрина не участвует в связывании AnkG. Это согласуется с нашим биохимическим результатом, показывающим, что удаление R13 не ухудшает взаимодействия анкирин / β-спектрин (рисунок S2A).
Рисунок 2: Общая структура комплекса AnkG exZZU / β2-спектрин R13-15 и общие черты, выявленные тремя сложными структурами.(A) Диаграмма с лентами ( слева и справа вверху, ) и комбинированные изображения с лентой и поверхностью (справа внизу) кристаллической структуры AnkG exZZU / β2-спектрина R13-15.ZU5 N (синий), ZU5 C (голубой), UPA (зеленый) и β2-спектрин (золотой) нарисованы в своих определенных цветах, и этот цветовой код используется во всей рукописи, если не указано иное.
(B) Суперпозиция всех трех структур, показывающая, что режимы связывания очень похожи. В этой суперпозиции ZU5 N использовался в качестве эталона для структурного выравнивания.
(C-E) Опустите карты, показывающие образование β-цепи за счет удлинения в AnkG / β2-спектрине (C), AnkB / β4-спектрине (D) и AnkG / β4-спектрине (E).Каждая карта плотности Fo-Fc была создана путем удаления последовательности удлинения из окончательной модели и очерчена на 2,5 σ.
Таблица 1:Статистика сбора рентгеноструктурных данных и уточнение модели
Руководствуясь структурой комплекса AnkG / β2-спектрин, мы смогли оптимизировать построение границ комплексов AnkB / β4-спектрин и AnkG / β4-спектрин. для кристаллизации и решил структуры этих двух комплексов с разрешением 3,4 Å и 4,3 Å, соответственно (рис. 2B-E и таблица 1).Общая архитектура трех пар структур анкирина exZZU / β-спектрина R13-15 по существу одинакова, включая супрамодуль ZU5 N -ZU5 C -UPA и основной ZU5 N / β-, подобный клеверному листу. Spectrin R14 интерфейс. Ориентация R13 и R15 по отношению к R14 в трех структурах немного отличается (Figure 2B), что неудивительно, учитывая, что конформации между спектриновыми повторами, как известно, частично эластичны в спектринах [41–44].
Структурная основа усиленного связывания спектрина за счет N-концевого удлинения анкиринов
На основе трех сложных структур мы проанализировали, как N-удлинение может усиливать связывание анкирина с β-спектрином. При построении структурных моделей мы наблюдали четкие концентрации электронов на N-конце по отношению к F992 в AnkG или F968 в AnkB (рис. 2C и 3D). Эти электронные плотности соответствуют остаткам от N-концевого удлинения. Для структур AnkG / β2-спектрина и AnkB / β4-спектрина была смоделирована дополнительная β-цепь и обозначена как β0, соответствующая N-концевому удлинению для каждого анкирина exZZU (рис. 2C и 2D).Низкое разрешение структуры AnkG / β4-спектрина не позволило нам уверенно построить модель атома, но очевидные концентрации электронов в разностной карте также указывают на образование β0 в exZU5 N в AnkG в комплексе с β4- спектрин (рис. 2E).
Рисунок 3: Подробное взаимодействие комплексов анкирин / β-спектрин на примере комплекса AnkB / β4-спектрин.(A) Дополнительный β0, образованный пакетами удлинения, к домену ZU5 N в основном за счет гидрофобных взаимодействий.ZU5 N структуры апо AnkB ZZUD окрашен в розовый цвет.
(B) UPA-домен участвует во взаимодействии посредством водородных связей. UPA-домен структуры апо AnkB ZZUD окрашен в розовый цвет.
(C-F) Результаты ITC, показывающие, что мутация ключевых остатков на границе раздела между AnkB exZZU и β4-спектрином ослабляет связывание.
Удивительно, но нет прямого контакта между β-спектрином и ZU5 N β0 как в структурах комплексов AnkG / β2-спектрин, так и AnkB / β4-спектрин.Мы предположили, что усиленное связывание может быть связано со стабилизацией ZU5 N дополнительной β-цепью (т.е. β0), образованной N-концевым удлинением. Нить β0 антипараллельно спарена с β1, что делает ZU5 N 13-нитевым β-цилиндром (рис. 3A). Два гидрофобных остатка в последовательности удлинения (I964 и F968 в AnkB exZZU, V986 и F992 в AnkG exZZU; Рисунок 1B) вставляются в гидрофобное ядро ZU5 N , что должно стабилизировать укладку домена ZU5.Тем не менее, эти два остатка не являются абсолютно необходимыми для полного сворачивания оставшихся 12 β-цепей ZU5 N , поскольку I964 отсутствует, а боковая цепь F968 обращена наружу (т.е. подвергается воздействию растворителя) в ранее решенном апо-AnkB. Структура ЗЗУД (PDB ID: 4D8O). Замена F968 на аланин уменьшала связывание exZZU / β2-спектрина AnkB более чем в десять раз (рис. 3D). Точно так же замена I964 полярным глутамином также ослабляла связывание примерно в четыре раза (рис. 3E).
Приведенный выше биохимический и структурный анализ показал, что за счет образования дополнительной β-цепи N-концевое удлинение может стабилизировать структуру ZU5 N и, следовательно, усилить связывание анкирина exZZU с β2-спектрином.
Домен UPA также участвует во взаимодействии анкирин-спектрин
Еще одно новое открытие из трех сложных структур, решенных в этом исследовании, заключается в том, что домен UPA анкирина exZZU непосредственно участвует в связывании с β-спектрином.Наложив структуры доменов UPA из комплекса AnkB exZZU / β4-спектрин и из структуры апо-AnkB ZZU (рис. 3B), мы могли наблюдать очевидный сдвиг и вращение спирали α1. Такой сдвиг и вращение облегчают несколько прямых полярных взаимодействий между остатками α1 UPA и R14 β-спектрина. Например, T1324 и Q1328 на AnkB exZZUD образуют водородные связи с D1773 и D1755 на β4-спектриновом повторе 14 соответственно. K1320 в петле, предшествующей α1 UPA, также образует солевой мостик с D1773 из β4-спектрина.В соответствии с приведенным выше структурным анализом замена T1324 в α1 UPA на Asp уменьшала взаимодействие между AnkB exZZU и β4-спектрином примерно в пять раз (рис. 3F).
Супрамодуль анкиринов exZZU функционирует как интегральная единица для связывания с β-спектрином
Обнаружение того факта, что оба домена анкиринов ZU5 N и UPA непосредственно участвуют в связывании с β-спектринами, побудило нас предположить, что в целом конформация (т.е. третичная структура) супрамодуля exZZU важна для взаимодействий анкирин-спектрин (рис. 4А).Наши предыдущие [40] и в настоящее время решенные структуры показали, что R1029 из AnkB ZU5 N имеет решающее значение для связывания ZU5 N / UPA, образуя солевые мостики с отрицательно заряженным остатком (D1319, как обнаружено предыдущей структурой AnkB ZZUD или D1318 как показано структурой, решенной здесь) из домена UPA (рис. 4B). Остатки, соответствующие R1029 и D1318 / 1319, полностью консервативны во всех изоформах анкиринов на протяжении всей эволюции (см. Рисунок 2 в Wang et al., 2012 для подробного анализа выравнивания последовательностей). Мы заменили R1029 AnkB на Glu, чтобы дестабилизировать соединение ZU5 N / UPA в супрамодуле exZZU. Мутация R1029E снижала связывание AnkB exZZU с β2-спектрином примерно в 5 раз (рис. 4C и 4D). Вышеупомянутые биохимические и структурные анализы предполагают, что соединение ZU5 N / UPA стабилизирует третичную структуру супрамодуля exZZU анкирина, которая требуется для высокоаффинных взаимодействий между анкиринами и β-спектринами.
Рисунок 4: Супрамодуль ZZU как единое целое для связывания с β-спектрином.(A) R1029 (красная сфера) находится в интерфейсе ZU5 N / UPA.
(B) R1029 имеет решающее значение для муфты ZU5 N / UPA, образуя солевой мостик с D1318. (C-D) Мутация с обратным зарядом R1029 снижает связывание между AnkB exZZU и β2-спектрином.
Обсуждение
В этом исследовании мы идентифицировали короткую и эволюционно консервативную последовательность, непосредственно предшествующую домену ZU5 N AnkB и AnkG.Он может значительно усилить связывание между AnkB / AnkG и β-спектринами. Мы продемонстрировали, что сродство связывания между AnkB / AnkG и β-спектринами находится в том же диапазоне, что и очень сильные парные связи между компонентами сети цитоскелета анкирин / актин, которые имеют решающее значение для стабильных сборок мембранных микродоменов (Рисунок S1; [1, 39,48–51]). Структуры AnkB / AnkG exZZU в комплексе с R13-15 β2 / β4-спектринов показывают, что N-концевое удлинение стабилизирует структуру домена ZU5 N за счет образования дополнительной β-цепи и, таким образом, усиливает связывание β-спектрина.Структуры комплексов анкирин / спектрин, решенные в этом исследовании, дополнительно показывают, что UPA-домен анкиринов непосредственно участвует в связывании с β-спектрином. Мы предоставили биохимические доказательства, чтобы показать, что третичное структурное расположение супрамодуля exZZU важно для взаимодействий между анкиринами и β-спектринами, подразумевая, что дальнодействующие конформационные пертурбации могут регулировать взаимодействия анкирин / β-спектрин. Эта третичная структурная потребность анкирина exZZU для связывания с β-спектрином может дать возможное объяснение того, почему определенные болезненные мутации в супрамодуле exZZU могут изменять связывание анкирина с β-спектрином, даже если такие сайты мутации находятся вдали от поверхности связывания β-спектрина. .
Переключатель сплайсинга, как недавно сообщалось, модулирует взаимодействие AnkG / β4-Spectrin в AIS во время развития нейронов [54-56]. Фактор сплайсинга Rbfox или Elavl3 может регулировать вставку мини-экзона, кодирующего дополнительные 11 аминокислотных остатков, в сайт между последовательностью удлинения и каноническим доменом ZU5 N как в AnkG, так и в AnkB (сайт вставки см. На Рисунке 1B). . Для изоформы сплайсинга AnkG, содержащей этот мини-экзон, связывание AnkG с β2- или β4-спектрином в значительной степени снижено, что продемонстрировано экспериментами по иммунопреципитации [54].Этот результат соответствует нашим структурным и биохимическим данным, представленным в этом исследовании. Ожидается, что вставка фрагмента из 11 остатков, кодируемого мини-экзоном, разрушит цепь β0, образованную последовательностью N-концевого удлинения в AnkG (а также в AnkB и AnkR), и тем самым снизит аффинность связывания между AnkG и β2. — / β4-спектрин. Таким образом, помимо прямого усиления взаимодействий между анкиринами и спектринами, N-концевое расширение супрамодуля ankyrin exZZU также служит в качестве опосредованного сплайсингом переключателя для модуляции их взаимодействий.
Удивительным и неожиданным открытием текущего структурного и биохимического исследования является то, что AnkB и AnkG используют очень похожий способ связывания для взаимодействия с разными β-спектринами и со сравнимой аффинностью (Рисунок 1 и Рисунок S2). Это открытие предполагает, что специфические пары между изоформами анкиринов и β-спектринов, наблюдаемые в отдельных микродоменах мембран живых клеток, не определяются исключительно высокоаффинными взаимодействиями между exZZU анкиринов и R13-15 β-спектринов.Должны быть определенные дополнительные механизмы, которые могут модулировать определенные пары между анкиринами и β-спектринами. Подтверждая это предположение, недавнее исследование показало, что гигантская вставка, кодируемая одним экзоном, кодирующим> 3000 аминокислотных остатков в 480 кДа AnkG, важна для рекрутирования β4-спектрина в AIS [57]. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы понять подробные механизмы, лежащие в основе конкретных пар между анкиринами и β-спектринами.
Материалы и методы
Конструкции, экспрессия и очистка белка
Все кодирующие последовательности конструкций AnkB были амплифицированы с помощью ПЦР из полноразмерной плазмиды кДНК AnkB человека 220 кДа (номера остатков указаны в NP_001341186.1). Все конструкции AnkG происходили из кДНК крысы 270 кДа (номера остатков согласно GenBank ID: AAC78143.1). Плазмиды-шаблоны AnkB и AnkG подарены доктором Ванн Беннеттом из Университета Дьюка. Кодирующие последовательности β-спектринов амплифицировали с помощью ПЦР из библиотек кДНК мозга или мышц. Соответствующие номера остатков различных повторов спектрина суммированы в таблице 2. Все точечные мутации были созданы с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза Quick Change (Agilent, CA) и подтверждены секвенированием ДНК.Все эти кодирующие последовательности были клонированы в модифицированные в домашних условиях векторы pET32a для экспрессии белка.
Таблица 2:Сводка границ конструкций β-спектрина
Рекомбинантные белки очищали, как описано ранее [39]. Вкратце, 200 нг плазмид трансформировали в 50 мкл Escherichia coli . Компетентные клетки BL21 (DE3) (New England Biolabs). На второй день клетки инокулировали в 1-2 л бульонной среды Lysogeny и инкубировали при 37 ° C со встряхиванием при 200 об / мин.Когда УФ-поглощение культивируемых клеток при 600 нм достигало 0,8, клетки индуцировали добавлением 0,25 мМ IPTG, и культуру переводили при 16 ° C на 20 часов при встряхивании при 200 об / мин. Затем клетки осаждали центрифугированием при 3000 g в течение 15 минут, ресуспендировали в 40 мл буфера для ресуспендирования (50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, pH 8,0) и лизировали с помощью гомогенизатора высокого давления при 4 ° C. с последующим высокоскоростным центрифугированием при 39000 g в течение 20 минут. Супернатант вводили в аффинную колонку с агарозой Ni 2+ -NTA (содержащую 5 мл шариков Ni 2+ -Sepharose 6 FF, GE Healthcare, Cat.17531803). Колонку инкубировали в течение 15 минут и дважды промывали 30 мл промывочного буфера (50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 15 мМ имидазол, pH 8,0). Затем белки на колонке элюировали 15 мл буфера для элюирования (50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 1 М имидазол, pH 8,0). Элюированные белки наносили на колонку для исключения размера (колонка HiLoad 26/600 Superdex 200 пг от GE Healthcare) с буфером, содержащим 50 мМ трис-HCl, 1 мМ DTT и 1 мМ EDTA, pH 7,8 с 100 мМ NaCl. Слитую метку Trx-His 6 расщепляли путем инкубации каждого рекомбинантного белка с протеазой HRV 3C в течение ночи при 4 ° C.Расщепленную метку каждого белка удаляли на другом этапе эксклюзионной хроматографии.
Анализ изотермической калориметрии титрования (ITC)
Измерения калориметрии изотермического титрования (ITC) проводили на калориметре VP-ITC Microcal (MicroCal, Нортгемптон, Массачусетс) при 25 ° C. Все очищенные образцы белка находились в реакционном буфере, содержащем 50 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 1 мМ DTT при pH 7,5. Белки спектрина в концентрациях 100-200 мкМ загружали в шприц, а белки анкирина в концентрациях 10-20 мкМ загружали в ячейку для образцов машины.Каждую точку титрования выполняли путем инъекции аликвоты 10 мкл (первая точка титрования 5 мкл) шприцевого белка в соответствующие образцы белка анкирина в ячейке с интервалом времени 120 секунд. Данные титрования анализировали с помощью программы Origin7.0 и подгоняли с помощью модели связывания с одним сайтом.
Кристаллография
Все кристаллы были получены методами диффузии пара через висящую или сидящую каплю при 16 ° C. Кристаллы AnkG exZZU / β2-спектрин R13-R15 выращивали в растворе, содержащем 10% мас. / Об. Полиэтиленгликоля 6000, 5% об. (+/-) — 2-метил-2,4-пентандиола и 0.1 M HEPES pH 7,5. Кристаллы AnkB exZZU / β4-спектрин R13-R15 выращивали в растворе, содержащем 25% (мас. / Об.) Пентаэритритолпропоксилата 629 (17/8 PO / OH), 50 мМ хлорида магния и 0,1 M HEPES, pH 7,5. Кристаллы AnkG exZZU / β4-спектрин R13-R15 выращивали в растворе, содержащем 0,8 М тетрагидрат тартрата калия-натрия, 0,1 М трис, pH 8,5 и 0,5% монометилового эфира полиэтиленгликоля 5000. Кристаллы замачивали в кристаллизационном растворе, содержащем дополнительно 20% глицерина для криозащиты.Все наборы данных были собраны на Шанхайской установке синхротронного излучения (BL17U1 или BL19U1) при 100 К. Данные были обработаны и масштабированы с помощью HKL2000 или HKL3000 [58].
Структуры были решены путем молекулярной замены с использованием PHASER [59] с AnkB ZZU (PDB: 4D8O) и β1-спектрином R13-R15 (PDB: 3KBT) в качестве моделей поиска. Дальнейшая ручная настройка и уточнение модели были выполнены итеративно с использованием COOT [60] и PHENIX [61]. Окончательные модели были проверены MolProbity [63], а статистические данные приведены в таблице 1.Все структурные рисунки были подготовлены PyMOL (http://www.pymol.org). Координаты структур, представленных в данной работе, депонируются в PDB.
Дополнительные обозначения к рисунку
Рисунок S1: Схема, показывающая многослойное расположение сети мембрана-анкирин-спектрин и сходство взаимодействий между ключевыми компонентами.Анкирин с его MBD, SBD и DD показан голубым цветом; Гетеротетрамеры αβ-спектрина представлены светло-фиолетовыми столбцами; аддуцин показан желтым цветом, а актин — светло-зеленым.В таблице внизу показаны данные о сродстве связывания (константы диссоциации или половинные максимальные концентрации) между ключевыми компонентами. « -» означает, что в данном исследовании не определено.
Рисунок S2: данныеITC, показывающие связывание различных конструкций AnkB с β2- (A) или β4- (B) или β1-спектрином (C).
