Остн 600 93: ОСТН-600-93 (Минсвязи России) Отраслевые строительно-технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения (Разделы 1, 2, 3), ОСТН от 15 июля 1993 года №600-93
| Статус документа на 2016: | Актуальный |
|---|
загрузить ОСТН 600-93 Отраслевые строительно-технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения быстро с базы данных
загрузить ОСТН 600-93 Отраслевые строительно-технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения быстро с базы данных| ТИ РО-024-2003 |
| ГОСТ Р 50776-95 Системы тревожной сигнализации. Часть 1. Общие требования. Раздел 4. Руководство по проектированию, монтажу и техническому обслуживанию |
| ОСТН 600-93 Отраслевые строительно-технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения |
| ГОСТ Р 52474-2005 Консервы. Соки, нектары и коктейли для питания детей раннего возраста. Технические условия |
| МУК 4.1.258-96 |
б) антрацит с содержанием свободного диоксида кремния до 5% 6 а IV Ф 38 Дноуглубительные работы -1284 Этилидендиацетат 30 п IV
312 0,0-Диметил-S/1,2-бис-карбоэтоксиэтил/дитиофосфат+ (карбофос) 0,5 п+а II
1056 1,5,5-Триметилциклогексенон-3 (изофорон) 1 п II * 1)
Заполнять печатными буквами!
857 Полибензоксазол 10 а III
536 Кислота ацетилсалициловая 0,5 а II
365 Динитро-окрезол+ 0,05 п+а I
113 Бария тетратитанат 0,5 а II
2-Метилпентанол 672305 Диметиламинная соль 2-метокси-3,6-дихлорбензойной кислоты (дианат) 1 а II103 Бальзам лесной марки А 50 п IV
ГОСТ 30528-97
773 Нитрил бензойной кислоты 1 п II390 1,1-Дифтор-2,2-дихлорэтилметиловый эфир (ингалан) 200 п IV
507 Калия ксантогенат бутиловый+ 10 а III
295 Диизопропиламин+ 5 п II
ТЕРМИНЫ, ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ 1091 Трихлортрифторэтан (фреон 113) 5000 п IV Тордон-22К 571
Дибром 318Экатин 352
ГОСТ 19098-87 Графопостроители для электронных вычислительных машин. Общие технические условия
д) алмаз металлизированный 4 а III Ф1261 Эритромицин+ 0,4 а II А
583 Кислота циануровая+ 0,5 а II
загрузить архив быстро с базы данных
ГОСТ 9568-80 Целлюлоза и бумага. Метод определения массовой доли кальция
Тилам 886
1089 2,3,6-Трихлортолуол+ 10 а III
2.6 Измерения температуры поверхностей ограждающих конструкций (стен, пола, потолка) или устройств (экранов и т.п.), наружных поверхностей технологического оборудования или его ограждающих устройств следует производить в рабочей зоне на постоянных и непостоянных рабочих местах.12 Категория работ Разграничение работ по тяжести на основе общих энергозатрат организма в ккал/ч (Вт).
614 Левомицетин 1 а II А
получить нтд сразу с хранилища
ГОСТ 27488.15-90 Гражданская оборона. Защита сельскохозяйственных животных от радиоактивных веществ при авариях на радиационно опасных объектах народного хозяйства. Общие требования
движения т. c./d577 Кислота хлорпеларгоновая 5 п III 487 Изопропилиденацетон+ (мезитила оксид) 1 п III
547 Кислота кремниевая (коллоидный раствор, по сухому остатку) в смеси:905 Свинец и его неорганические соединения (по свинцу) 0,01/0,005 а I
Стрептоцид 40
1196 0-/2-Хлор-1-(2,4,5-трихлорфенил) винилин/-0,0-диметилфосфат (гардона) 1 а II
1074 Трифторхлорпропан+ 1 п II586 Кобальта оксид+ 0,5 а II А1106 Углерод четыреххлористый* 20 п II
284 Дигидрат перфторацетона+ 2 п III
461 Диэтилхлортиофосфат 1 п IIМельпрекс 464
1087 1,2,3-Трихлорпропилен 3 п III
б) мучная, древесная и др. (с примесью диоксида кремния менее 2%) 6 а IV А, Ф
Трихлорметафос-3 713
Примечания:1. Величины ПДК и классы опасности утверждает и при необходимости пересматривает Минздрав СССР. Величины значений ПДК приведены по состоянию на 01.01.88. Синонимы, технические и торговые названия веществ приведены в приложении 3.
Дихлор 419225 Гексахлорбензол+ 0,9 п+а II1155 Фтористоводородной кислоты соли (по F):3.8. Расчетную интенсивность движения для международных дорог следует определять как наибольшую интенсивность движения в час, достигаемую или превышаемую в течение 50 h в год учета. Ее необходимо рассчитывать по формуле923 Скипидар в пересчете на С) 300 п IV275 Дибромбензатрон 0,2 а II
получить нтд мигом с хранилища взять гост быстро с файлового архива 3) номер пункта учета, длина участков учета;1088 Трихлорсилан+ (по HCl) 1 п II а) Аланин 5 а III 1222 Цианурат меламина+ 0,5 а II
Error 404 — Законодательство, нормативные акты, образцы документов
1. «Орал
Орал қалалық мәслихатының 2014 жылғы 25 қарашадағы № 30-5 «Орал қаласында аз қамтамасыз етілген отбасыларға (азаматтарға) тұрғын үй көмегін көрсетудің мөлшерін және тәртібін айқындау туралы қағидасын бекіту туралы» шешіміне өзгерістер енгізу туралы Батыс Қазақстан облысы Орал қалалық мәслихатының 2015 жылғы 3 желтоқсандағы № 39-3 шешімі Қазақстан Республикасының 2001 жылғы 23 қаңтардағы «Қазақстан Республикасындағы жергілікті мемлекеттік басқару және өзін-өзі басқару туралы» және 1997 жылғы 16 сәуірдегі «Тұрғын үй қатынастары туралы» Заңдарына сәйк Далее…2. «
«Қазақстан Республикасы ұлттық қауіпсіздік комитеті органдарының әскери, арнаулы оқу орындарында іске асырылатын жоғары және жоғары оқу орнынан кейінгі білім беру мамандықтары бойынша үлгілік оқу жоспарларын бекіту туралы» Қазақстан Республикасы Ұлттық қауіпсіздік комитеті Төрағасының 2016 жылғы 13 қаңтардағы № 9/ҚБП бұйрығына өзгерістер енгізу туралы» Қазақстан Республикасы Ұлттық қауіпсіздік комитеті Төрағасының 2016 жылғы 10 қазандағы № 67/ҚБП бұйрығы. Қызмет бабында пайдалануға арналған және Деректер базасына енгізілмейді Далее…3. Утверждены Правила согласования размещения предприятий и других сооружений, а также условий производства строительных и других работ на водных объектах, водоохранных зонах и полосах (аннотация к документу от 01.09.2016)
Утверждены Правила согласования размещения предприятий и других сооружений, а также условий производства строительных и других работ на водных объектах, водоохранных зонах и полосахАннотация к документу: Приказ Заместителя Премьер-Министра Республики Казахстан — Министра сельского хозяйства Республики Казахстан от 1 сентября 2016 года № 380 «Об утверждении Правил согласования размещения предприятий и других сооружений, а также условий производства строительных и других работ на водных объектах, водоохранных зонах и полосах»В соответствии с подпунктом 7-5) пункта 1 статьи 37 Водного кодекса Республики Казахстан от 9 июля 2003 год Далее…4. Утверждены Правила регулирования цен на услуги, производимые и реализуемые субъектами государственной монополии в области связи (аннотация к документу от 24.10.2016)
Утверждены Правила регулирования цен на услуги, производимые и реализуемые субъектами государственной монополии в области связиАннотация к документу: Приказ Министра информации и коммуникаций Республики Казахстан от 24 октября 2016 года № 221 «Об утверждении Правил регулирования цен на услуги, производимые и реализуемые субъектами государственной монополии в области связи»В соответствии с подпунктом 1) пункта 2 статьи 20 Закона Республики Казахстан от 5 июля 2004 года «О связи» утверждены Далее…5. Утверждены Правила формирования перечня энергопроизводящих организаций, использующих возобновляемые источники энергии (аннотация к документу от 09.11.2016)
Утверждены Правила формирования перечня энергопроизводящих организаций, использующих возобновляемые источники энергииАннотация к документу: Приказ Министра энергетики Республики Казахстан от 9 ноября 2016 года № 482 «Об утверждении Правил формирования перечня энергопроизводящих организаций, использующих возобновляемые источники энергии»В соответствии с подпунктом 10-3) статьи 6 Закона Республики Казахстан от 4 июля 2009 года «О поддержке использования возобновляемых источников энергии» утверждены Далее…6. Изменения внесены в ряд приказов Министра энергетики Республики Казахстан (аннотация к документу от 31.05.2016)
Изменения внесены в ряд приказов Министра энергетики Республики КазахстанАннотация к документу: Приказ Министра энергетики Республики Казахстан от 31 мая 2016 года № 228 «О внесении изменений в некоторые приказы Министра энергетики Республики Казахстан»В частности, изменения внесены в приказ Министра энергетики Республики Казахстан «Об утверждении Правил пользования тепловой энергией», изменения затронули понятия и определения используемые в правилах. Также, изменения внесены в ряд пунктов правил, а именно: Далее…7. Заканчивается срок приема заявлений по легализации имущества
Заканчивается срок приема заявлений по легализации имущества Вниманию всех заинтересованных лиц!Напоминаем, что 31 декабря 2016 года заканчивается легализация имущества, которая проводилась с 1 сентября 2014 года в соответствии с Законом РК от 30 июня 2014 года № 213-V «Об амнистии граждан Республики Казахстан, оралманов и лиц, имеющих вид на жительство в Республике Казахстан, в связи с легализацией ими имущества».При этом, срок подачи документов для легализации недвижимого имущества, находящегося на территории Республики Казахстан, заканчился 30 ноября 2016 года, а для иного имущества срок подачи документов завершается за 5 рабочих дней до конца 2016 года, то есть не позднее 23 декабря 2016 года. Далее…8. 31 декабря истекает срок уплаты налога на транспорт физическими лицами
31 декабря истекает срок уплаты налога на транспорт физическими лицами Вниманию физических лиц, имеющих на праве собственности транспортные средства!Срок уплаты налога на транспортные средства истекает 31 декабря 2016 года.Обратите внимание, что с 1 января 2016 года уплата налога физическими лицами производится по месту жительства.В случае осуществления регистрационных действий по передаче права собственности на транспортное средство, сумма налога, подлежащая уплате за фактический период владения таким объектом лицом, передающим эти права, должна быть внесена в бюджет до совершения указанных действий.Уплата налога на транспортные средства физическим лицом, являю Далее…9. О дифференциации доходов и расходов населения в Республике Казахстан за 3 квартал 2016 года
О дифференциации доходов и расходов населения в Республике Казахстан за 3 квартал 2016 года По результатам выброчного обследования домашних хозяйств доля населения, имеющего доходы ниже величины прожиточного минимума (уровень бедности), в Республике Казахстан в 3 квартале 2016 года составила 2,5%, по сравнению с соответствующим периодом предыдущего года оставшись на том же уровне. Вместе с тем, по-прежнему, сохраняется разрыв между уровнем бедности среди городского и сельского населения. Наибольшее значение уровня бедности в 3 квартале 2016 года зарегистрировано в Южно-Казахстанской (5,0%), Атырауской и Жамбылско Далее…10. Сагинтаев поручил акимам «удержать» инфляцию
Сагинтаев поручил акимам «удержать» инфляцию Премьер-министр РК Бакытжан Сагинтаев поручил акимам регионов работать по «удержанию» инфляции в коридоре 6-8%, передает корреспондент Zakon.kz.«В прошлый раз мы говорил о том, что необходимо оставаться в коридоре 6-8% по инфляции. 11 месяц мы грубо так провалили и вот я еще раз обращаюсь к акимам регионов, чтобы в декабре 2016 года мы удержали инфляцию с тем, чтобы остаться в коридоре 6-8%. Работу будем продолжать. На следующей неделе еще поговорим по итогам», — сказал он на заседании Правительства РК.В то же время Глава Кабмина отметил, что тенденция по росту экономики в Казахстане по итогам 11 месяцев положительная.«Мы видим, что хорошие показатели имеем, тенденция положительная. И, если мы по итогам полугодия говорили о том, что было бы хорошо, чтобы мы год Далее…11. Обзор пользователей интернет-услуг ЕНПФ за декабрь 2016 года
Обзор пользователей интернет-услуг ЕНПФ за декабрь 2016 года Количество вкладчиков, выбравших метод веб-информирования Единого накопительного пенсионного фонда, на декабрь 2016 года составляет 2,77 миллиона человек. Доля пользователей онлайн услуг ЕНПФ за год выросла с 13% до 29%.Всего за год число абонентов фиксированного интернета в РК выросло на 201 тысячу, до 2,27 миллиона. Из них 55 тысяч количество новых абонентов сельской местности, всего — 436 тысяч.За 5 лет количество интернет-абонентов в РК выросло почти вдвое — на 93%. При этом показатели села подскочили почти втрое (на 179%). Далее…12. Ликвидация организации как основание прекращения производства по гражданскому делу (Тимур Данабаев, практикующий юрист)
Ликвидация организации как основание прекращения производства по гражданскому делу Тимур ДанабаевПрактикующий юрист Подпунктом 8) статьи 277 Гражданского процессуального кодекса Республики Казахстан (далее — ГПК РК) предусмотрено, что суд прекращает производство по делу если организация, выступающая стороной по делу, ликвидирована с прекращением ее деятельности и отсутствием правопреемников. Указанные ниже вопросы свидетельствуют о наличии определенных сложностей с толкованием и практическим применением в судебной практике указанной нормы права, а также о существовании различных (нередко противоречивых) подходов к ее применению. Рассмотрим эти Далее…13. Розничная торговля за ноябрь 2016 года
Розничная торговля за ноябрь 2016 года Средний чек на городского жителя в ноябре 2016 составил 66,2 тысячи тенге — на 7,5% больше, чем годом ранее. Объем ритейла за год вырос на 9,6%, и достиг 669,1 млрд тг.В ноябре объем официальной розничной торговли составил 669,1 млрд тг — на 0,3% (+2,1 млрд тг) больше, чем в октябре, и на 9,6% (+58,7 млрд тг) больше, чем годом ранее.Примечательно, что положительную динамику обеспечили регионы, в то время как обе столицы, концентрирующие 35,5% всего ритейла по РК, в минусе по отношению к октябрю 2016.Наибольший месячный прирост отмечен в Павлодарской области (почти на треть, до 36,5 млрд тг) и Жамбылской области (+17,2%, до 20 млрд тг). Далее…14. Утвержден Генеральный план города Атырау (аннотация к документу от 29.11.2016)
Утвержден Генеральный план города Атырау Аннотация к документу: Постановление Правительства Республики Казахстан от 29 ноября 2016 года № 749 «О Генеральном плане города Атырау Атырауской области (включая основные положения)» (не введено в действие)В соответствии со статьей 19 Закона Республики Казахстан от 16 июля 2001 года «Об архитектурной, градостроительной и строительной деятельности в Республике Казахстан» и в целях обеспечения комплексного развития города Атырау Атырауской области Правительство Республики Казахстан утвержден Далее…15. Реализация кадровой политики в Национальном бюро по противодействию коррупции (аннотация к документу от 21.10.2016)
Реализация кадровой политики в Национальном бюро по противодействию коррупцииАннотация к документу: Приказ Председателя Агентства Республики Казахстан по делам государственной службы и противодействию коррупции от 21 октября 2016 года № 18 «О некоторых вопросах реализации кадровой политики в Национальном бюро по противодействию коррупции (Антикоррупционной службе) Агентства Республики Казахстан по делам государственной службы и противодействию коррупции»В соответствии с подпунктом 9) статьи 5-1, Далее…16. Особенности исполнения налогового обязательства при ликвидации и прекращении деятельности (ДГД по Восточно-Казахстанской области, 15 ноября 2016 г.)
Особенности исполнения налогового обязательства при ликвидации и прекращении деятельности Законом Республики Казахстан от 29 декабря 2014 года № 269-V «О внесении изменений и дополнений в некоторые законодательные акты Республики Казахстан по вопросам кардинального улучшения условий для предпринимательской деятельности в Республике Казахстан» внесены существенные изменения в части ликвидации предприятий и ИП, а именно, предоставлена возможность закрытия по результатам аудиторской проверки. В Кодекс Республики Казахстан «О налогах и других обязательных платежах в бюджет» (далее- Налоговый кодекс) введена новая статья 37-2 «Ос Далее…17. Вернуть в административное законодательство (Ержан Карабаев, председатель апелляционной судебной коллеги по уголовным делам Мангистауского областного суда)
Вернуть в административное законодательство Ержан Карабаев, председатель апелляционной судебной коллеги по уголовным делам Мангистауского областного суда В судебной практике казахстанских судов возникают проблемные вопросы при рассмотрении уголовных дел по уголовным проступкам и при назначении наказаний за их совершение. Далее…18. Повышая доверие к правосудию (Малик Жаркынбеков, судья Актюбинского областного суда)
Повышая доверие к правосудию Малик Жаркынбеков, судья Актюбинского областного суда VII внеочередной Съезд судей Республики Казахстан определил основные направления совершенствования деятельности судов по эффективной защите прав, свобод, достоинства и собственности граждан государства.В целом работа Съезда была нацелена на становление прочной, современной, демократической судебной системы как одной из главных составляющих развития страны, развития нашего государства в среднесрочной и дальней перспективе. Далее…19. К эффективной реализации реформ (М. Рысбеков, председатель СМЭС Павлодарской области)
К эффективной реализации реформ М. Рысбеков, председатель СМЭС Павлодарской области К 25-й годовщине Независимости мы подходим с новой казахстанской мечтой, которая тождественна главной цели реализуемой нами «Стратегии-2050». К середине ХХІ века мы планируем добиться вхождения Казахстана в число 30 самых развитых государств мира.Лидер нации, выступая на XVI Съезде партии «Нур Отан Далее…20. Снизить размеры взысканий (Ермек Махметов, судья САС г. Актобе)
Снизить размеры взысканий Ермек Махметов, судья САС г. Актобе Долгое время, начиная с момента обретения Казахстаном независимости, административному законодательству, регулирующему административно-деликтные правоотношения, не уделялось должного внимания, оно являлось наследием советского времени, сохранив в себе карательно-репрессивный характер.На VI Съезде судей Главой государства были обозначены пять приоритетных задач, направленных на модернизацию судебной системы, в числе которых дальнейшее совершенствование законодательства, внедрение альтернативных способов разреш Далее…Отраслевые строительно-технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения
Отраслевые строительно-технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевиденияСкачать PDF
| Документ: | ОСТН 600-93 |
| Название: | Отраслевые строительно-технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения |
| Начало действия: | 1994-01-01 |
| Завершения срока действия: | 2003-11-21 |
| Вид документа: | ОСТН |
Постраничный просмотр! Все страницы Отдельные страницы: << 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 >>
=’mso-no-proof: yes’>4
2 -12
2
0,5
0,5
0,55
3; 5 — 12
3
0,65
0,6
0,65
4 — 12
4
0,8
0,75
0,8
13 — 24
6
1,1
0,95
1,05
3.21. Глубина траншей для трубопроводов на вводах в колодцы должна соответствовать нормам, приведенным в табл. 3.3.
3.22. Все каналы трубопровода должны быть закрыты бетонными, деревянными или пластмассовыми пробками после окончания прокладки каждого пролета канализации, & также при перерывах в процессе производства работ (на ночь, перед нерабочими днями и др.).
3.23. Расстояние между асбестоцементными трубами в ряду, а также расстояние между рядами (по вертикали) должно составлять 20-25 мм. Расстояние между рядами полиэтиленовых и винипластовых труб 50 мм.
Промежутки между трубами, а также между последними и стенками траншей должны быть плотно заполнены мягким грунтом или песком.
Таблица 3.3
|
Типы труб и место их прокладки |
Глубина, м, при числе рядов труб по высоте |
|||||
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
Асбестоцементные, полиэтиле-новые, винипластовые, стальные с каналами диаметром 100 мм в пешеходной части |
0,82 |
0,96 |
1,10 |
1,24 |
1,38 |
1,52 |
|
в проезжей части
|
0,92 |
Все страницы Постраничный просмотр: << 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 >> | ||||
profitsec.ru » Строительные нормы
ВСН 015-89 Строительство магистральных и промысловых трубопроводов. Линии связи и электропередачи
ВСН 25-09.66-85 Правила разработки проектов производства работ на монтаж автоматических установок пожаротушения и установок охранной, пожарной и охранно-пожарной сигнализации
ВСН 25-09.67-85 Правила производства и приемки работ. Автоматические установки пожаротушения
ВСН 45.122-77 Инструкция по проектированию искусственного освещения предприятий связи
ВСН 60-89 Устройства связи, сигнализации и диспетчеризации инженерного оборудования жилых и общественных зданий. Нормы проектирования
ВСН 116-93 Инструкция по проектированию линейно-кабельных сооружений связи
ВСН 123-90 Инструкция по оформлению приемосдаточной документации по электромонтажным работам
ВСН 332-93 Инструкция по проектированию электроустановок предприятий и сооружений электросвязи, проводного вещания, радиовещания и телевидения
ВСН 333-93 Инструкция по проектированию проводные средства связи и почтовая связь. Производственные здания
ВСН 601-92 Допустимые уровни шума на предприятиях связи
ВСН-604-III-87 Техника безопасности при строительстве линейно-кабельных сооружений
Нормы приёмосдаточных измерений элементарных кабельных участков магистральных и внутризоновых подземных волоконно-оптических линий передачи сети связи общего пользования
ОСТН 600-93 Отраслевые строительно-технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения
СН 512-78 Инструкция по проектированию зданий и помещений для электронно-вычислительных машин
СНиП 2.04.01-85 Внутренний водопровод и канализация зданий
СНиП 3.05.05-84 Технологическое оборудование и технологические трубопроводы
СНиП 21-01-97 Пожарная безопасность зданий и сооружений
Пособие по производству и приемке работ при устройстве систем вентиляции и кондиционирования воздуха (к СНиП 3.05.01-85)
Типовая методика по приемке и вводу в эксплуатацию серийных городских и сельских АТС импортных поставок
Всн 600 81 инструкция по монтажу сооружений и устройств связи и радиовещания и телевидения :: rescousuwa
Не действует Утвержден: Госстрой СССР Государственный комитет Совета Министров СССР по делам строительства, Обозначение: ВСН 0 81 Наименование: Инструкция по монтажу сооружений и устройств связи. ВСН.
0 81 Инструкция по монтажу сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения. В проектах устройств связи, сигнализации и диспетчеризации инженерного. Скачать ОСТН 0 93 Отраслевые строительно технологические нормы на. На.
Монтажу сооружений и устройств связи. Москва 1994. ВСН 0 81 Минсвязи СССР Инструкция по монтажу сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения не действует.
ВСН 0 81 Инструкция по монтажу сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения. Технологические нормы на монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения. Текст документа ВСН.
0 81 Инструкция по монтажу. Наименование: Инструкция по монтажу сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения. МИНСВЯЗИ России. Скачать ОСТН 0 93 Отраслевые строительно технологические нормы на. Расположен в: Отраслевые и. Инструкция по.
Монтаж сооружений и устройств связи, радиовещания и телевидения. Дата принятия. ВСН 0 81 Минсвязи СССР Инструкция по монтажу сооружений и. ВСН 0 81 Инструкция по монтажу сооружений и устройств связи. Статус:.
Вместе с Всн 600 81 инструкция по монтажу сооружений и устройств связи и радиовещания и телевидения часто ищут
всн 600-81 статус.
остн 600-93 статус.
всн 600-81 pdf.
всн 600-81 на украине.
всн 600-93.
что вместо остн-600-93.
остн 600-93 pdf.
всн 116-93
Читайте также:
Инструкция фотовспышка canon speedlite 430ex ii
Детское питание нутрилон инструкция
Должностная инструкция сборщик
Пособие инженеру ПТО по исполнительной документации. Связь (С, СС)
← предыдущий раздел | вернуться к содержанию | читать далее →
Связь (С, СС)Связь (С, СС) делается по ВСН 015-89, ОСТН 600-9, документация сдается по ЕДИНОЕ РУКОВОДСТВО ПО СОСТАВЛЕНИЮ ИСПОЛНИТЕЛЬНОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ НА ЗАКОНЧЕННЫЕ СТРОИТЕЛЬСТВОМ ЛИНЕЙНЫЕ СООРУЖЕНИЯ ПРОВОДНОЙ СВЯЗИ.
Сама исполнительная на монтажные работы делается несколько по иному принципу, нежели все остальное. ИД будет без всех тех документов и ведомостей как при всех других спецмонтажных работах, останется только начальный реестр, перечень организаций и ответственных лиц, ВК с актами и журналами, общий журнал работ и предписания с уведомлениями плюс все, что требуется по этому руководству (никакие другие формы, как например по ВСН123-90 не используйте). Так как это руководство делалось на линейные сооружения, там куча документов, от которых необходимо сразу отмазаться в перечне либо в процессе. Основные проблемы возникнут при оформлении результатов испытаний, которые обычно никто не делает, сами вы их тоже никак не сделаете.
Так же могут понадобиться формы по «РУКОВОДСТВО ПО ПРОЕКТИРОВАНИЮ И ЗАЩИТЕ ОТ КОРРОЗИИ ПОДЗЕМНЫХ МЕТАЛЛИЧЕСКИХ СООРУЖЕНИЙ СВЯЗИ» для ЭХЗ линий связи и «РУКОВОДСТВО ПО СТРОИТЕЛЬСТВУ ЛИНЕЙНЫХ СООРУЖЕНИЙ МАГИСТРАЛЬНЫХ И ВНУТРИЗОНОВЫХ КАБЕЛЬНЫХ ЛИНИЙ СВЯЗИ».
Работы по беспроводной связи (РЛ, РТ) антенные мачты оформляются в основном по общестрою и по ОСТН 600-93, на установленное оборудование оформляете ведомость смонтированной арматуры и оборудования по ВСН 012-88 ч.2 потому как в связи ничего подобного нет. Форм актов передачи в наладку и приемки в эксплуатацию я нигде не нашел, так что придется делать по произвольным. После наладки и испытаний должны так же оформляться соответствующие документы, какие именно – хер его знает.
← предыдущий раздел | вернуться к содержанию | читать далее →
Пособие инженеру ПТО по исполнительной документации (полный текст пособия)
Раздел 459.96948 — Принятие посредством ссылки определенных публикаций, касающихся процедур сбора проб, аналитических методологий и требований к сертификации, Nev. Admin. Кодекс § 459.96948
Действует до 9 ноября 2020 г.
Раздел 459.96948 — Принятие посредством ссылки определенных публикаций, касающихся процедур сбора проб, аналитических методологий и требований к сертификации 1. Комиссия настоящим принимает посредством ссылки следующие публикации в наиболее распространенных формах. опубликовано недавно, если Комиссия не уведомит об этом в соответствии с положениями NAC 459.9699, что самая последняя публикация не подходит для этого государства. Публикации доступны, если иное не предусмотрено в этом разделе, по почте из Национальной службы технической информации, 5285 Port Royal Road, Springfield, Virginia 22161, или по телефону (800) 553-6847. Публикации также можно получить в Национальной службе технической информации по Интернет-адресу http://www.ntis.gov/ordering.htm . Публикации: (a) Метод консенсуса для определения подземных вод под прямым влиянием поверхностных вод с использованием анализа микрочастиц (MPA) , EPA / 910 / 9-92 / 029, номер заказа PB93-180818, по цене 37 долларов. (b) Руководство по аналитическим методам DBP / ICR , EPA / 814 / B-96/002, номер для заказа PB96-157516, по цене 52 доллара США. (c) ICR Microbial Laboratory Manual , EPA / 600 / R-95/178, номер для заказа PB96-157557, по цене 74 доллара США. (d) Руководство по отбору проб для ИЦР , апрель 1996 г., EPA / 814 / B-96/001, номер для заказа PB96-157508, по цене 52 доллара США. (e) Руководство по сертификации лабораторий, анализирующих питьевую воду: критерии и процедуры, обеспечение качества , 4-е издание, EPA / 815 / B-97/001, номер заказа PB97-171490, по цене 51 доллар США. (f) Метод 100.2: Определение структур асбеста длиной более 10 микрометров в питьевой воде , июнь 1994 г., EPA / 600 / R-94/134, номер заказа PB94-201902, по цене 33,50 долл. США. (г) Метод 1613: Сквозные октахлорированные диоксины и фураны путем изотопного разбавления HRGC / HRMS, редакция B , октябрь 1994 г., EPA / 821 / B-94/005, номер заказа PB95-104774, для цена 39,50 долларов. (h) Метод 1664, редакция A: экстрагируемый N-гексаном материал (HEM; масло и консистентная смазка) и экстрагируемый N-гексаном материал, обработанный силикагелем (SGT-HEM; неполярный материал) путем экстракции и гравиметрии , февраль 1999, EPA / 821 / R-98/002, номер заказа PB99-121949, по цене 33 доллара.50. Публикация также доступна бесплатно в Агентстве по охране окружающей среды по адресу в Интернете http://www.epa.gov/ost/methods/1664f051.html . (i) Методы определения неорганических веществ в пробах окружающей среды , август 1993 г., EPA / 600 / R-93/100, номер заказа PB94-120821, по цене 52 доллара США. (j) Методы определения металлов в пробах окружающей среды , EPA / 600 / 4-91 / 010, номер для заказа PB91-231498, по цене 81 доллар. (k) «Методы определения металлов в пробах окружающей среды», Приложение I , EPA / 600 / R-94/111, номер для заказа PB95-125472, по цене 74 доллара США. (l) Методы определения нетрадиционных пестицидов в городских и промышленных сточных водах, том I, редакция 1 , август 1993 г., EPA / 821 / R-93 / 010A, номер заказа PB94-121654, по цене 152,50 долл. США . (м) «Методы определения органических соединений в питьевой воде», Приложение 1 , EPA / 600 / 4-90 / 020, номер для заказа PB91-146027, по цене 68 долларов США.50. (n) «Методы определения органических соединений в питьевой воде», Приложение 2 , EPA / 600 / R-92/129, номер для заказа PB92-207703, по цене 74 доллара США. (o) «Методы определения органических соединений в питьевой воде», Приложение 3 , EPA / 600 / R-95/131, номер для заказа PB95-261616, по цене 117 долларов США. (p) Методы измерения острой токсичности сточных вод и принимающих вод для пресноводных и морских организмов , 4-е издание, EPA / 600 / 4-90 / 027F, номер заказа PB94-114733, по цене 81 доллар. (q) Краткосрочные методы оценки хронической токсичности сточных вод и полученной воды для пресноводных организмов , 3-е издание, EPA / 600 / 4-91 / 002, номер заказа PB96-141452, по цене 86,50 долларов США. (r) Краткосрочные методы оценки хронической токсичности сточных вод и поступающей воды для морских и устьевых организмов , 2-е издание, EPA / 600 / 4-91 / 003, номер для заказа PB96-141445, по цене 111,50 долларов США. (s) Технические примечания по методам питьевой воды , EPA / 600 / R-94/173, номер заказа PB95-104766, по цене 37 долларов США. (t) Методы испытаний на «Escherichia Coli» в питьевой воде: среда ЕС с пробиркой из кружки, процедура для питательного агара с мембранным фильтром кружки , EPA / 600 / 4-91 / 016, номер заказа PB91-234591, для цена 17,50 $. (u) Программа контрактной лаборатории USEPA: описание работ по анализу органических веществ: мультимедиа, многоконцентрация, OLM01.0 (включает версии от OLM01.1 до OLM01.8) , EPA / 540 / R-94 / 078, номер заказа PB95-963508, по цене 100 долларов США.Публикация также доступна бесплатно в Агентстве по охране окружающей среды по адресу в Интернете http://www.epa.gov/superfund/programs/clp/organic.htm . (v) Программа контрактной лаборатории USEPA: Техническое задание для анализа неорганических веществ: мультимедиа, многоконцентрация, ILM02.1 , EPA / 540 / R-94/095, номер заказа PB95-963514, по цене 81 доллар. Публикация также доступна бесплатно в Агентстве по охране окружающей среды в Интернете по адресу http: // www.epa.gov/superfund/programs/clp/inorg.htm . 2. Комиссия настоящим принимает посредством ссылки следующие публикации в формах, опубликованных последними, если только Комиссия не уведомит в соответствии с положениями NAC 459.9699, что последняя публикация не подходит для этого государства. Публикации можно получить по почте в Национальной службе технической информации, 5285 Port Royal Road, Springfield, Virginia 22161, или по телефону (800) 553-6847. Публикации: (a) Промежуточная радиохимическая методология для питьевой воды , EPA / 600 / 4-75-008, номер для заказа PB253258, по цене 37 долларов. (b) Метод 100.1: Аналитический метод определения асбестовых волокон в воде , сентябрь 1983 г., EPA / 600 / 4-83-043, номер заказа PB83-260471, по цене 78,50 долл. США. (c) «Методы химического анализа воды и отходов», EPA / 600 / 4-79-020 , номер для заказа PB84-128677, по цене 117 долларов США. (d) Методы определения органических соединений в питьевой воде , пересмотренный в июле 1991 г., EPA / 600 / 4-88 / 039, номер заказа PB91-231480, по цене 89 долларов.50. (e) Предписанные процедуры измерения радиоактивности питьевой воды , EPA / 600 / 4-80-032, номер заказа PB80-224744, по цене 47,50 долларов США.Нев. Админ. Кодекс § 459.96948
Добавлен в NAC Комиссией по охране окружающей среды R061-04, эфф. 10-7-2004NRS 459.485, 459.500
OET — Бюллетени в Интернете | Федеральная комиссия связи
Навигационные ссылки
Выберите номер бюллетеня: 7473727170696563626160565337
Обратите внимание:
Эти документы предназначены для справки и могут не отражать новейшие правила или процедуры.Они могут отличаться по формату от оригинальных публикаций. Некоторые документы также могут быть разбиты на страницы иначе, чем задумал автор.
Бюллетень OET № 74 (26 октября 2015 г.)- Методология Лонгли-Райса для прогнозирования межсервисных помех широковещательному телевидению от мобильных беспроводных широкополосных услуг в диапазоне УВЧ (2015)
- В этом бюллетене представлена методика прогнозирования помех от базовых станций фиксированной беспроводной связи в спектре нисходящей линии связи 600 МГц для приема сигналов из областей обслуживания цифрового телевидения с полной мощностью и класса A, которые работают на совмещенном или смежном канале для мобильных широкополосных беспроводных сетей.
- Загрузить:
- Дополнение A — Руководство по прогнозированию межсервисных помех радиовещательному телевидению в диапазоне ОВЧ от систем положительного управления поездом (PTC)
- Компьютерная программа ILLR для прогнозирования силы сигналов цифрового телевидения в отдельных местах
(2010) - В этом бюллетене публикуется подробное определение модели для двухточечного прогнозирования интенсивности сигналов цифрового телевидения (DTV).Эта модель была принята Комиссией в соответствии с Законом о расширении и локализации спутникового телевидения 2010 года (STELA).
- Загрузить:
- Компьютерная программа ILLR
- В этом бюллетене приводится подробное определение компьютерной программы Лонгли-Райса для независимого местоположения (ILLR), установленной в Разделе 73.683 (d) правил Федеральной комиссии связи США в качестве средства прогнозирования напряженности поля телевещательного телевидения, принимаемого в отдельных местоположениях.Комиссия разработала компьютерную программу ILLR в соответствии с указаниями Конгресса в Законе о совершенствовании спутникового домашнего просмотра от 1999 года (SHVIA). Программа вычисляет прогнозируемую мощность сигнала аналоговых телевизионных станций, принимаемого по радиоканалу в отдельных местах просмотра. Отдельные места, где уровень сетевого ТВ-сигнала ниже определенного уровня сигнала, имеют право принимать сетевое вещание в качестве абонентских услуг спутникового ТВ. Программа используется поставщиками услуг спутникового телевидения для определения того, могут ли определенные сигналы телевизионной сети быть включены в пакет каналов, доставляемых отдельным абонентам.Чтобы облегчить использование программы другими, в этом бюллетене приведены подробные сведения об установке программы на другие компьютеры.
- Загрузить:
- Руководство по тестированию и проверке точности систем определения местоположения E911
- Этот бюллетень разъясняет применение правил FCC для беспроводной связи Enhanced911 (E911). Эти правила устанавливают программу, гарантирующую, что, когда вызывающий абонент по беспроводному телефону набирает 911, центр обработки вызовов 911 будет знать географическое местоположение вызывающего абонента, чтобы ускорить отправку помощи на место происшествия.Правила FCC требуют, чтобы операторы беспроводной связи соответствовали определенным стандартам точности и надежности при сообщении местоположения вызовов службы экстренной помощи. В этом бюллетене разъясняется, как можно тестировать и проверять работу систем и оборудования определения местоположения на соответствие правилам точности.
- Загрузить:
- Распространение миллиметровых волн: последствия для управления использованием спектра
- Распространение миллиметровых волн имеет свои особенности.В этой статье рассматриваются характеристики распространения миллиметровых волн, включая распространение в свободном пространстве, и влияние различных физических факторов на распространение. Он был создан, чтобы предоставить легкую для понимания справочную информацию, объясняющую характеристики распространения радиосигналов на частотах миллиметрового диапазона и их значение для управления использованием спектра.
- Загрузить:
- Методология Лонгли-Райса для оценки телевизионного покрытия и помех
- Этот бюллетень предоставляет руководство по внедрению и использованию методологии Лонгли-Райса для оценки покрытия ТВ-услугами и помех в соответствии с Разделами 73.622, 73.623 и 74.704 правил FCC.
- Скачать
- Оценка соответствия директивам FCC по воздействию радиочастотных электромагнитных полей на человека
- Настоящий пересмотренный бюллетень OET 65 был подготовлен для оказания помощи в определении того, соответствуют ли предлагаемые или существующие передающие средства, операции или устройства ограничениям на воздействие на человека радиочастотных (РЧ) полей, принятым Федеральной комиссией по связи (FCC). и предложения по оценке соответствия.Однако он не предназначен для установления обязательных процедур, и другие методы и процедуры могут быть приемлемыми, если они основаны на надежной инженерной практике.
- Загрузить:
- Бюллетень
- Приложение А
- Приложение B
- Приложение C
- Публичные уведомления
- Понимание правил FCC, часть 15 для маломощных нелицензионных передатчиков
- Этот бюллетень был подготовлен, чтобы дать общее представление о правилах FCC для маломощных нелицензированных передатчиков, и включает ответы на некоторые часто задаваемые вопросы.Настоящая редакция бюллетеня не содержит информации о передатчиках услуг персональной связи (PCS), работающих в соответствии с Частью 15 Подчасти D правил. Правила и нормы FCC, регулирующие использование передатчиков PCS, можно найти в 47 CFR, Части 0–19. Этот бюллетень также не охватывает недавние изменения в правилах для устройств, работающих на частотах выше 40 ГГц (миллиметровые волны). Эти изменения будут обсуждаться в следующих выпусках этого бюллетеня.
- Загрузить:
- Понимание правил FCC для компьютеров и других цифровых устройств
- Этот бюллетень подготовлен с целью дать общее представление о правилах FCC для цифровых (вычислительных) устройств и включает ответы на некоторые часто задаваемые вопросы.Информация в этом бюллетене отражает действующие правила и нормы, регулирующие использование цифровых устройств. Ожидается, что эти правила и положения скоро изменятся в результате окончательных действий, которые будут приняты в отношении Уведомления о предлагаемых правилах (NPRM), принятого в ET Docket 95-19. В NPRM FCC предлагает внести поправки в части 2 и 15 правил, чтобы отменить требования к авторизации оборудования для цифровых устройств.
- Загрузить:
- Программа авторизации оборудования FCC для радиочастотных устройств
- FCC разработала программу авторизации оборудования для контроля радиопомех от радиопередатчиков и некоторых других электронных устройств.Этот бюллетень предназначен для обзора программы и получения разрешения на использование оборудования.
- Загрузить:
- Требования к многоканальной телевизионной передаче звука и обработке звука для системы BTSC
- Этот бюллетень содержит технические характеристики системы BTSC, разработанной Ассоциацией электронной промышленности, 2001 Eye Street, N.W. Вашингтон, округ Колумбия, 20006. Эти спецификации были опубликованы в соответствии с Отчетом и распоряжением в BC Docket 21323, принятым 39 марта 1984 г., и представляют собой рекомендации для станций, использующих систему BTSC для многоканальной передачи звука и обработки звука.
- Загрузить:
- Вопросы и ответы о биологических эффектах и потенциальных опасностях радиочастотных электромагнитных полей
- Это информационный бюллетень, написанный в результате растущего интереса и озабоченности общественности по поводу этого вопроса.Расширение использования радиочастотной технологии привело к спекуляциям относительно предполагаемого «электромагнитного загрязнения» окружающей среды и потенциальных опасностей воздействия неионизирующего излучения. Эта публикация предназначена для предоставления населению фактической информации путем ответов на некоторые из наиболее часто задаваемых вопросов. Она включает последнюю информацию о рекомендациях FCC по воздействию радиочастотной энергии на человека.
- Загрузить:
- Спецификация совместимости наземной станции мобильной станции сотовой системы
- Этот бюллетень содержит технические характеристики, гарантирующие, что мобильная станция может получить обслуживание в любой сотовой системе.
- Загрузить:
- Критерии, которым должны соответствовать доплеровские радары, работающие в 24.05-24,25 ГГц Диапазон частот
- Загрузить:
Новый зеленый курс Александрии Окасио-Кортес может стоить 93 триллиона долларов
По мнению республиканского аналитического центра, возглавляемого бывшим директором бюджетного управления Конгресса, амбициозный план представителя Александрии Окасио-Кортес по борьбе с изменением климата не будет дешевым.
Так называемый Новый зеленый курс может составить от 51 до 93 триллионов долларов за 10 лет, заключает American Action Forum, которым руководит Дуглас Хольц-Икин, который руководил беспартийным CBO с 2003 по 2005 год.
Это включает от 8,3 триллиона до 12,3 триллиона долларов для удовлетворения требований плана по устранению выбросов углерода в энергетическом и транспортном секторах и от 42,8 триллиона до 80,6 триллиона долларов на его экономическую повестку дня, включая создание рабочих мест и здравоохранение для всех.
«Зеленый новый курс явно стоит очень дорого», — говорится в анализе группы. «Его дальнейшее расширение роли федерального правительства в принятии некоторых из самых основных решений повседневной жизни, однако, вероятно, будет иметь более длительные и разрушительные последствия, чем его огромная цена.»
Почему Вашингтон так вспоминает о« зеленом новом курсе »: QuickTake
Сторонники плана говорят, что бездействие будет дороже. Сама резолюция, опубликованная ранее в этом месяце Окасио-Кортесом и сенатором-демократом от штата Массачусетс Эд Марки, указывает на крупный доклад о глобальном потеплении, опубликованный Организацией Объединенных Наций в октябре прошлого года, в котором говорится, что катастрофическое изменение климата может стоить более 500 миллиардов долларов ежегодно в виде потери экономического производства в США к 2100 году.
«Любой так называемый« анализ »#GreenNewDeal, который включает искусственно завышенные числа, основанные на ленивых предположениях, в т.ч. о политике, которой даже нет в резолюции, является подделкой, — сказал Марки в Твиттере. — Ставить цену на решение принципов, а не политики, — это просто дезинформация Big Oil ».
Представители нью-йоркского демократа Окасио-Кортез не сразу ответили на запрос о комментариях.
республиканцев поддержали масштабный план, потому что они думают, что могут использовать его, чтобы выставить демократов как крайних, занять вторые места в Конгрессе и, возможно, сохранить Белый дом в 2020 году.
(Обновления с комментарием автора резолюции в шестом абзаце)
Прежде чем оказаться здесь, он находится на терминале Bloomberg.
УЗНАТЬ БОЛЬШЕДеградация белка корректирует несбалансированную стехиометрию субъединиц в сборке комплекса OST
Abstract
Деградация белка важна для клеточного гомеостаза. Мы разработали чувствительный подход к изучению скорости деградации белка в Saccharomyces cerevisiae путем сочетания подхода SILAC с масс-спектрометрией для мониторинга выбранных реакций (SRM).В сочетании с генетическими инструментами этот анализ позволил изучить сборку комплекса олигосахарилтрансферазы. Связанный с ER механизм деградации компенсирует нарушенный гомеостаз компонентов комплекса за счет избыточной деградации субъединиц. В более крупном масштабе было обнаружено, что деградация белка в ER является второстепенным фактором в регуляции гомеостаза белка в экспоненциально растущих клетках, но ERAD стал актуальным, когда была затронута доза гена, как продемонстрировано на гетерозиготных диплоидных клетках.Следовательно, уменьшение нарушений приспособленности из-за аномального числа копий гена может быть важной функцией деградации белка.
ВВЕДЕНИЕ
Белковый оборот — это процесс, вызванный потерей старых и синтезом новых белков. Замена белков может быть важна для клеточных процессов, таких как регуляция клеточного деления (Lecker et al. , 2006). Кроме того, взаимодействие между транскрипцией, трансляцией и деградацией белка регулирует изобилие белка (Gygi et al., 1999; Фогель и Маркотт, 2012). Сбалансированное содержание белка особенно важно для образования мультибелковых комплексов, и деградация может быть средством корректировки уровней белка в соответствии с соотношением субъединиц. Одной из причин несбалансированной экспрессии белка является анеуплоидия, при которой один или несколько генов отсутствуют или являются избыточными. Это состояние приводит к протеотоксическому стрессу; это основная причина умственной отсталости и ключевая характеристика раковых клеток (Weaver and Cleveland, 2006; Oromendia et al., 2012; Оромендия и Амон, 2014; Дуйф и Бенезра, 2013).
Белковые комплексы выполняют многие клеточные функции; например, транслокон SEC транспортирует белки в эндоплазматический ретикулум (ER), протеасома разрушает клеточные белки, а комплекс / циклосома, способствующий анафазе (APC / C), управляет прохождением через клеточный цикл. Другой комплекс, олигосахарилтрансфераза (OST), является центральным ферментом аспарагин-связанного (N-) гликозилирования и присоединяет гликаны к секвонам N-X-S / T на белках в просвете ER (Breitling and Aebi, 2013).В дрожжах Saccharomyces cerevisiae OST состоит из восьми белков, включая две взаимоисключающие тиоредуктазы Ost3p и Ost6p. Имеется лишь ограниченная информация о сборке или деградации OST, но предыдущие биохимические и генетические данные предполагают, что сборка включает стабильные субкомплексы (Schwarz et al. , 2005; Kelleher and Gilmore, 2006). Анализ других белковых комплексов показал, что субъединицы стабилизируют друг друга во время сборки и что белки включаются в комплекс в определенной последовательности (Johnson et al., 1998; Asher et al. , 2006; Дейли, 2008).
ER-ассоциированная деградация (ERAD) составляет основную часть деградации белков из ER (Thibault and Ng, 2012). Этот путь распознает неправильно свернутые белки в ER и перенаправляет их в цитозоль для протеасомной деградации (Ruggiano et al. , 2014). У дрожжей ключевыми компонентами являются два комплекса E3 ubiquitin ligase, комплексы HRD1 и DOA10, которые распознают и убиквитилируют неправильно свернутые белки.ERAD в основном изучается путем анализа быстро разрушающихся мутировавших белков, таких как PrA * и CPY * (Finger et al. , 1993; Xie et al. , 2009). Как правило, в таких исследованиях используется установка с отслеживанием импульсов, чтобы отличить старый белок от вновь синтезированного, что связано с методами обнаружения на основе SDS-PAGE. Крупномасштабные исследования с этой установкой непрактичны, поскольку в эксперименте отслеживается только один белок. Чтобы увеличить возможности исследований деградации белка в дрожжах, мы объединили метод отслеживания импульсов, основанный на мечении стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC), с масс-спектрометрией дробовика (MS; Pratt et al., 2002). Такой подход позволил определить скорость деградации сотен белков в одном эксперименте. Однако, несмотря на прогресс в технологиях МС и повышение чувствительности масс-спектрометров, последовательное обнаружение белков с низким содержанием оставалось трудным. Адаптация этого крупномасштабного метода для анализа белков с низким содержанием требует более чувствительного метода МС, такого как мониторинг выбранных реакций (SRM). Этот целевой метод МС контролирует только выбранные пептиды и их фрагменты в трехквадрупольных масс-спектрометрах, генерируя данные высокой чувствительности и охватывая большой динамический диапазон (более четырех порядков; Lange et al., 2008). При правильной оптимизации SRM генерирует качественные количественные данные с хорошей воспроизводимостью, избегая проблемы пропущенных точек данных, типичной для экспериментов МС с дробовиком (Picotti et al. , 2009; Soste and Picotti, 2013). Эти качества делают его особенно подходящим для анализа белков с низким содержанием и для исследований, в которых необходимо контролировать выбранные целевые белки — например, все субъединицы белкового комплекса (Picotti and Aebersold, 2012).
Мы реализовали чувствительный метод SILAC-SRM для анализа 25 белков-мишеней с различным содержанием клеток в нескольких мутантах дрожжей.Этот подход выявил низкие уровни ERAD для белков в клетках дикого типа. Кроме того, мы изучили, как комплекс OST реагирует на изменение численности субъединиц. На основе наших результатов мы предлагаем последовательность событий для сборки комплекса OST, а также представляем понимание динамики белковых комплексов в целом.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Реализация чувствительного метода SILAC-SRM для измерения деградации белка
Целью данного исследования было проанализировать оборот белковых комплексов мембраны ER в S.cerevisiae , с упором на ОСТ. Кроме того, мы проанализировали транслокон SEC, комплексы PMT, шапероны ER (Kar2p, Pdi1p), известные субстраты ERAD (PrA, Pdr5p) и контрольные белки (Rpl5p, Rps1ap, Ilv5p), которые удаляются медленно (Pratt et al. , 2002; Belle et al. , 2006; Schwanhausser et al. , 2011).
Попытки контролировать все представляющие интерес белки с помощью МС с дробовиком оказались безуспешными из-за низкой чувствительности этого метода сбора данных.Поэтому мы соединили погоню SILAC с получением SRM (SILAC-SRM;). Белки метили путем культивирования клеток во встряхиваемых колбах со средой, содержащей тяжелые изотопы аргинина (R 6 ) и лизина (K 8 ). Затем клетки переносили в среду с легкими изотопами аргинина и лизина (R 0 , K 0 ). В разные моменты времени клетки собирали и лизировали, мембраны и фракции просвета собирали, белки солюбилизировали и расщепляли Lys-C и трипсином.В каждый момент времени соотношение тяжелых и легких пептидов регистрировали с помощью SRM на масс-спектрометре QTRAP (дополнительная таблица S1). Скорость потери белка ( k LOSS ) рассчитывали путем аппроксимации линейной кривой. Скорости разведения ( k DIL ) при делении клеток вычитали из k LOSS , чтобы получить скорости разложения ( k DEG ; Larrabee et al. , 1980). Используя метод SILAC-SRM, мы смогли определить скорость деградации 25 целевых белков, включая восемь субъединиц OST.
Анализ деградации белков с помощью SILAC-SRM. (A) Схематическое изображение метода SILAC-SRM. После мечения дрожжевых белков тяжелым аргинином (R 6 ) и лизином (K 8 ) клетки переносили в легкую среду. Клетки отбирали в разные моменты времени, а белки готовили для масс-спектрометрии. Изменения в соотношении тяжелых и легких пептидов обнаруживались с помощью SRM. Скорости потерь ( k LOSS ) рассчитывали с помощью аппроксимации линейной кривой, и степени разведения ( k DIL ), соответствующие потере белка в результате деления клеток, вычитали, что давало скорости разложения ( k DEG ).(B) Проверка метода SILAC-SRM с использованием PrA. SRM-следы пептида FDGILGLGYDTISVDK PrA в клетках, экспрессирующих версию белка PrA * -aB (SMA822) или PrA * -Ab (SMA823). (C) k DEG значения для PrA в клетках, экспрессирующих версию белка PrA * -aB (SMA822) или PrA * -Ab (SMA823). Скорости разложения рассчитывали, как описано в A. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение трех биологических повторов. *** p ≤ 0,001. (D) Значения k DEG для PrA в клетках дикого типа (SMA1648) или Δhrd1Δdoa10 (SMA1649), содержащих плазмиду экспрессии PrA или контрольные векторы (SMA1574, SMA1584).Скорости разложения рассчитывали, как описано в A. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение трех биологических повторов. Пунктирная линия показывает период полураспада в восемь делений клеток.
Чтобы проверить, точно ли метод SILAC-SRM определяет период полужизни белка, мы использовали модельный субстрат ERAD PrA *, неправильно свернутый вариант гликопротеина PrA (Finger et al. , 1993). PrA * имеет два гликозита, и гликан на первом сайте важен для эффективного ERAD. В PrA * -Ab занят только первый гликозит, а в PrA * -aB только второй.Это влияет на скорость разложения PrA * -Ab и PrA * -aB через ERAD (быстро и медленно, соответственно; Spear and Ng, 2005). Клетки, дефицитные по PrA, трансформировали плазмидами экспрессии PrA * -aB или PrA * -Ab. Следы SRM и скорости разложения показали, что PrA * -Ab быстро разлагается, тогда как PrA * -aB был более стабильным (и). Полученные значения согласуются с соответствующими периодами полураспада, полученными в классических экспериментах по отслеживанию импульсов, о которых сообщается в литературе (Spear and Ng, 2005).
Когда мы сверхэкспрессировали PrA в клетках дикого типа и в ERAD-дефицитных клетках Δhrd1Δdoa10 , скорости деградации PrA были сходными между клетками дикого типа и мутантными клетками.Период полувыведения PrA составлял> 12 ч (или более восьми раз удвоения;). Таким образом, за время, в течение которого заданное количество PrA было уменьшено в 2 раза за счет деградации, деление клеток разбавило то же количество в 2 раза 8 = 256. Следовательно, вклад деградации в обмен белка был минимальным, и в соответствии с предыдущими сообщениями, мы классифицировали PrA как «стабильный» (Finger et al. , 1993). По результатам этих экспериментов мы пришли к выводу, что метод SILAC-SRM является чувствительным и надежным подходом для измерения оборота белков и дает точные периоды полураспада по сравнению с ранее используемыми методами.Его чувствительность и постоянство делают SRM особенно подходящим для анализа белков со средним и низким содержанием (потенциально всего 50 копий на клетку) и субъединиц белковых комплексов (Picotti et al. , 2009), что открывает множество возможностей для применения метод.
Белки стабильны в экспоненциально растущих дрожжевых клетках
Затем мы исследовали, устраняет ли и в какой степени система ERAD другие белки, включая субъединицы комплекса OST, комплекса транслокона SEC, комплексов PMT и шаперонов ER ( Kar2p, Pdi1p;).Мы провели импульсные эксперименты на клетках дикого типа (ERAD-компетентные) и Δhrd1Δdoa10 (ERAD-дефицитные) клетки, изолированные фракции мембранного и везикулярного содержимого, а также экстрагированные и переваренные белки. Белковый обмен для 25 целевых белков анализировали с помощью SRM (). Все эти белки были стабильными в клетках дикого типа, и для большинства белков мы не обнаружили значительных различий в скорости деградации в клетках дикого типа по сравнению с таковыми, наблюдаемыми в клетках Δhrd1Δdoa10 ().Кроме того, Pmt2p был стабильным в обоих типах клеток, несмотря на статистически разные периоды полураспада ( t 1/2 17 против 42 часов). Таким образом, в экспоненциально растущих клетках ERAD имеет второстепенное значение для гомеостаза анализируемых белков.
Низкий уровень деградации белка в экспоненциально растущих дрожжевых клетках. (A) Схематическое изображение локализации и функции целевого белка. Белки синтезируются рибосомами и попадают в ЭР через транслокон SEC.Они гликозилированы OST (N-гликаны) или комплексами PMT (O-гликаны). Фолдингу помогают шапероны Pdi1p и Kar2p. Следующими белками-мишенями были вакуолярная протеаза PrA, переносчик плазматической мембраны Pdr5p и митохондриальный белок Ilv5p. Субъединицы OST окрашены в зеленый, желтый или оранжевый цвет в соответствии с субкомплексами, как было предложено ранее (Kelleher and Gilmore, 2006). (B) Значения k DEG для 25 белков-мишеней в клетках дикого типа (SMA673) или Δhrd1Δdoa10 (SMA1566).Скорость разложения измеряли, как описано в. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение трех биологических повторов. * p ≤ 0,05. Оборот Ost4p не мог быть определен, поскольку триптический гидролизат давал только пептид с 35 остатками (из 36 в целом), который был слишком длинным для точного анализа с помощью МС. (C) Период полураспада белка в экстрактах цельных клеток. Были приготовлены экстракты цельных клеток дикого типа (SMA673), белки расщеплены для MS, измерены с помощью LC-MSMS и количественно определены с помощью MaxQuant.Результаты трех биологических повторов. (D) Белки с периодом полужизни <12 ч (в среднем из трех биологических повторов) из экстракта цельных клеток в C. Пунктирная линия указывает период полужизни в восемь делений клеток.
Чтобы проанализировать, является ли низкий уровень деградации общей характеристикой дрожжевых белков, мы наблюдали за оборотом белков во всех клеточных фракциях. С этой целью мы приготовили экстракты целых клеток из клеток дикого типа, меченных импульсным методом, путем лизиса стеклянными шариками в детергенте.Экстракты были обработаны для масс-спектрометрии и проанализированы методом МС с дробовиком. Периоды полураспада были получены для 188 белков из цитозоля, митохондрий, ядра, Гольджи, ER, клеточной стенки и вакуоли. Большинство обнаруженных белков были стабильными в условиях культивирования, использованных в этом исследовании (и). Поскольку большинство из 25 белков-мишеней, которые мы ранее измерили с помощью SILAC-SRM, не были обнаружены вообще или не были обнаружены во всех трех временных точках, мы не смогли рассчитать скорость разложения. Однако мы смогли обнаружить Pdi1p, Kar2p и Rps1ap, которые снова были стабильными, как в экспериментах SILAC-SRM.Из 188 проанализированных белков только восемь показали период полураспада <12 часов. В эту группу вошли белки, которые справляются с окислительным повреждением (Sod1p, Ahp1p), а также известный быстро разлагающийся рибосомный белок (Rps31p) и белок, участвующий в синтезе эргостерола (Erg11p), путь, который содержит несколько ферментов, количество которых регулируется деградацией. (и; Hampton and Rine, 1994; Helbig et al. , 2011; Jaenicke et al. , 2011). На основании этих экспериментов мы предположили, что большинство белков были стабильными в экспоненциально растущих дрожжевых клетках в условиях, используемых в наших экспериментах.
Сверхэкспрессия субъединиц OST деградирует со специфической для белка скоростью
На следующем этапе мы специально изменили уровни белка и проанализировали влияние сверхэкспрессии одной субъединицы на оборот компонентов OST. Клетки дикого типа и клетки Δhrd1Δdoa10 трансформировали плазмидой с высоким числом копий, несущей экспрессионную копию STT3 . Stt3p является важным мембранным белком и действует как каталитическая субъединица комплекса OST, перенося N-гликаны на аспарагиновые остатки белков.Сначала мы проанализировали установившиеся уровни компонентов ОЗТ с помощью SDS – PAGE и иммуноблоттинга (). Как и ожидалось, Stt3p присутствовал в более высоких количествах в клетках, содержащих плазмиду сверхэкспрессии, по сравнению с контрольными клетками, тогда как уровни белка оставались такими же для других отслеживаемых нами субъединиц (Ost1p, Ost3p и Wbp1p). Анализ гликопротеина CPY показал, что гликозилирование не изменилось при сверхэкспрессии STT3 . Эксперимент повторяли для всех других субъединиц OST с теми же результатами: сверхэкспрессия одной субъединицы не влияла ни на уровни белка других субъединиц, ни на гликозилирование CPY (данные не показаны).Мы пришли к выводу, что комплекс OST остается неповрежденным и функциональным в присутствии сверхэкспрессированных субъединиц.
Сверхэкспрессия субъединиц OST приводит к повышенной деградации. (A) Иммуноблот-анализ сверхэкспрессии Stt3p. Экстракты SDS получали из клеток дикого типа (SMA1578) или Δhrd1Δdoa10 (SMA1588), содержащих плазмиду экспрессии STT3 и векторных контролей (SMA1574, SMA1584). Равные количества белков разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали иммуноблоттингом с указанными антителами.(B) Значения k DEG для субъединиц OST в клетках дикого типа или Δhrd1Δdoa10 клетках, содержащих либо плазмиду экспрессии STT3 (SMA1578 или SMA1588, соответственно), либо векторные контрольные (SMA1574 или SMA1584). Скорости разложения измеряли, как описано в SILAC-SRM. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение в трех биологических повторностях. *** p ≤ 0,001. (C) k DEG значения для сверхэкспрессированного Swp1p (SMA1576), Ost2p (SMA1577), Ost1p (SMA1582) и Stt3p (SMA1578) в ERAD-компетентных клетках.Скорости разложения определяли, как описано в SILAC-SRM. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение в трех биологических повторностях. Пунктирная линия показывает период полураспада в восемь делений клеток.
Затем мы измерили скорость деградации сверхэкспрессированного Stt3p в клетках дикого типа и Δhrd1Δdoa10 клеток. Stt3p был стабильным при нормальном уровне (). Напротив, сверхэкспрессированный Stt3p разлагался с большей скоростью в клетках дикого типа и в клетках Δhrd1Δdoa10 , но его период полужизни был значительно выше в клетках Δhrd1Δdoa10 (4.4 часа), чем в клетках дикого типа (1,3 часа), демонстрируя, что деградация сверхэкспрессированного Stt3p зависит в первую очередь от функциональной системы ERAD. Все остальные субъединицы OST оставались стабильными. Подобно Stt3p, сверхэкспрессированные Ost1p, Ost2p и Swp1p быстро деградировали в клетках дикого типа (). Интересно, что скорости разложения для каждого белка значительно различались с периодом полураспада 3,9 (Ost1p), 0,9 (Ost2p) и 1,5 часа (Swp1p; p <0,05). С другой стороны, субъединицы OST, которые не были сверхэкспрессированы, оставались стабильными в этих штаммах.Вместе с предыдущими находками наши данные предполагают, что полностью собранные комплексы OST остаются нетронутыми, тогда как избыточные субъединицы были нестабильными и разрушались со специфической для белка скоростью аппаратом ERAD (Jakob et al. , 2001). Однако важно отметить, что сверхэкспрессии белка недостаточно для деградации белка, как показано для сверхэкспрессии PrA ().
Удаление существенных субъединиц дестабилизирует комплекс OST
Наши результаты показали, что интеграция субъединиц OST в комплекс предотвращает их деградацию.На следующем этапе мы проанализировали влияние делеций одной субъединицы на деградацию компонента OST. Чтобы изучить эффект делеции существенной субъединицы OST, мы воспользовались открытием, что плазмидный белок STT3D из Leishmania major (LmSTT3D) может функционально заменять дрожжевой OST (и; Nasab et al. , 2008 ). LmSTT3D представляет собой односубъединичную олигосахарилтрансферазу, которая гликозилирует большинство белков при экспрессии в дрожжевых клетках, но не включается в дрожжевой комплекс OST.В присутствии LmSTT3D клетки, содержащие делецию в одной из субъединиц OST, остаются полностью жизнеспособными (). Клетки дикого типа, Δstt3 и Δwbp1 , несущие плазмиду LmSTT3D, анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга (). Делеция Stt3p и Wbp1p имела разные эффекты: оба приводили к снижению уровней Ost3p и Ost6p в присутствии сверхэкспрессированного LmSTT3D, а удаление WBP1 дополнительно снижало уровни Swp1p. Различия не были вызваны сверхэкспрессией LmSTT3D в клетках дикого типа, поскольку уровни Ost3p и Ost6p были одинаковыми в клетках дикого типа, несущих пустой вектор или плазмиду сверхэкспрессии (неопубликованные данные).В то время как CPY был полностью гликозилирован в клетках Δstt3 , субъединица Wbp1p была гипогликозилирована, что указывает на то, что LmSTT3D полностью гликозилировал многие, но не все гликопротеины дрожжей ().
Удаление важных субъединиц OST влияет на стабильность других компонентов комплекса. (A) Схематическое изображение LmSTT3D, компенсирующего N-гликозилирование в клетках Δwbp1 . LmSTT3D гликозилирует дрожжевые белки и обеспечивает жизнеспособность клеток в отсутствие функционального дрожжевого OST. (B) Иммуноблот-анализ делеций OST.Экстракты SDS получали из клеток, несущих плазмиду экспрессии LmSTT3D (белок, меченный гемагглютинином) и содержащих все субъединицы OST (дикий тип, SMA1603) или делеции в STT3 (SMA1604) или WBP1 (SMA1605). Равные количества белка разделяли на 10% геле SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны с последующим обнаружением специфическими антителами. Сигнал Ost3p обозначен стрелкой, чтобы отличить его от неспецифического сигнала. Гексокиназу (HXK) использовали в качестве контроля загрузки.(C) Значения k DEG для субъединиц OST в диком типе (SMA1603) или в клетках, удаленных в STT3 (SMA1604) или WBP1 (SMA1605) и несущих плазмиду экспрессии LmSTT3D . Скорости разложения рассчитывали, как описано в SILAC-SRM. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение трех биологических повторов. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Пунктирная линия показывает период полураспада в восемь делений клеток.
В следующей серии экспериментов мы измерили деградацию белка с помощью SILAC-SRM в клетках дикого типа, дополненных LmSTT3D, Δstt3 и Δwbp1 .Удаление как STT3 , так и WBP1 привело к деградации нескольких субъединиц OST, но не повлияло на субъединицы SEC и PMT, которые мы проанализировали (; неопубликованные данные). В ячейках Δstt3 Ost3p ( t 1/2 = 2,4 часа), Ost6p (3,0 часа) и Ost5p (3,8 часа) быстро разлагались, и скорость разложения Ost1p ( t 1/2 = 20,2 ч) и Wbp1p (11,7 ч) были значительно выше, чем в клетках дикого типа. В ячейках Δwbp1 Swp1p ( t 1/2 = 1.0 ч), Ost2p (1,2 ч), Ost3p (2,1 ч) и Ost6p (3,0 ч) деградировали. Stt3p ( т 1/2 = 4,4 ч) и Ost5p (8,5 ч) также были утилизированы, но более медленными темпами. Мы пришли к выводу, что интеграция субъединиц в полностью собранный комплекс предотвращает их деградацию; Напротив, отсутствие Stt3p и Wbp1 дестабилизировало другие субъединицы. Мы предположили, что это явление в основном применяется к белкам-партнерам соответствующего субкомплекса или к субъединицам, которые входят в комплекс после удаленного компонента.
Изучение содержания белка выявляет последовательность событий в сборке комплекса OST
Наши результаты согласуются с опубликованными данными, показывающими, что субъединицы мембранных белковых комплексов стабилизируют друг друга и собираются последовательно через стабильные промежуточные соединения (Daley, 2008). Для дальнейшего выяснения сборки OST мы контролировали уровни субъединиц в клетках, удаленных в одной из девяти субъединиц OST, с использованием стационарного SILAC-SRM (и). Гранулы равного веса клеток дикого типа, выращенных в среде с тяжелыми изотопами аргинина и лизина, и клеток с делецией в одной субъединице OST, выращенных в среде с легкими изотопами, объединяли.Оба типа клеток несли плазмиду экспрессии LmSTT3D. Клетки лизировали, мембраны собирали, белки готовили для MS, а пептиды измеряли с помощью SRM (и). Помимо компонентов OST, мы также отслеживали поведение SEC-транслокона и субъединиц PMT, а также гликопротеина Pdr5p плазматической мембраны. За исключением Pdr5p, большинство этих белков обнаруживают незначительные изменения. Мы пришли к выводу, что различия отражают активность эндогенного OST и фермента LmSTT3D.
Дифференциальное влияние делеции субъединицы на стабильность компонента OST.(A) Схематическое изображение для анализа SILAC клеток с делецией субъединицы OST. LmSTT3D-комплементарный дикий тип и клетки с делецией субъединицы ( Δost4 ) выращивали в среде, содержащей тяжелые (WT) или легкие ( Δost4 ) аминокислоты. Объединяли равные количества клеток, экстрагировали белки и готовили пептиды для масс-спектрометрии. Отношения легких и тяжелых для всех пептидов OST измеряли с помощью SRM. Рассчитывали количество субъединиц относительно дикого типа. Значения были нормализованы к среднему значению всех белков, не относящихся к OST.Уменьшение количества субъединицы, как для Ost3p и Ost6p, указывает на ее дестабилизацию за счет делеции Δost4 . (B) Количества компонентов OST относительно дикого типа (SMA1603 или SMA1651) в клетках, удаленных в одной субъединице и содержащих плазмиду экспрессии LmSTT3D (SMA1604-1609, YG2073, YG2075, YG2080), анализировали, как описано в. Значения были нормализованы путем деления на среднее значение для всех белков, не относящихся к OST (SEC, компоненты PMT, Pdr5p). За исключением удаления OST4, черная полоса указывает количество удаленной субъединицы, которое создается фоновым сигналом во время измерений SRM.Планки погрешностей представляют собой 95% доверительный интервал среднего значения трех биологических повторов.
Для субъединиц OST мы наблюдали реакцию, специфичную для каждой делеции: делеция в WBP1 , SWP1 или OST2 снижала уровни всех этих белков, указывая на то, что три субъединицы стабилизировали друг друга ( ). Кроме того, Wbp1p, Swp1p и Ost2p присутствовали в сходных количествах относительно друг друга во всех других клетках, включая Δost1 (83–88%) и Δstt3 клеток (86–92%).Мы обнаружили аналогичный сценарий для OST1 , STT3 и OST5 : делеция в OST1 снизила уровни Stt3p и Ost5p до <20% от уровней дикого типа. Делеция STT3 снижает уровни белка Ost1p и Ost5p до 68%, тогда как делеция OST5 не влияет на уровни каких-либо других субъединиц. Более того, три субъединицы Ost1p, Ost5p и Stt3p присутствовали в одинаковых количествах относительно друг друга во всех других клетках, включая Δwbp1 (65–83%), Δswp1 (72–93%) и Δost2 . клетки (73–86%).Опять же, это указывает на взаимную стабилизацию этих трех субъединиц. Мы отметили, что Ost1p был стабильным в экспериментах SILAC-SRM с клетками Δwbp1 , но его уровни были снижены в стабильных экспериментах SILAC-SRM с теми же клетками (и). Таким образом, определение относительных уровней белка может быть более чувствительным и может обнаруживать небольшие различия в стабильности, которые не видны в экспериментах с отслеживанием импульсов. Возможно, что оставшиеся субкомплексы в конечном итоге разлагаются с очень медленной кинетикой, которая не обнаруживается в эксперименте SILAC-SRM, но становится очевидной при анализе стационарных уровней.
В клетках Δost4 уровни только Ost3p и Ost6p были снижены, что согласуется с предыдущими выводами о том, что Ost4p необходим для закрепления Ost3p или Ost6p в комплексе OST (Spirig et al. , 2005). Делеции OST3 и OST6 не влияли на уровни любой из других субъединиц, тогда как уровни Ost3p и Ost6p снижались при удалении любой из других субъединиц, кроме Ost5p (). Это указывает на то, что Ost3p и Ost6p входят в комплекс только после того, как все остальные субъединицы были собраны.Наши находки подтвердили, что Wbp1p, Swp1p и Ost2p с одной стороны, и Ost1p, Ost5p и Stt3p с другой стороны, формируют два субкомплекса, которые могут действовать как промежуточные соединения во время сборки комплексов. Ost4p вошел в комплекс после двух подкомплексов и закрепил Ost3p или Ost6p в комплексе OST (Spirig et al. , 1997, 2005).
ERAD компенсирует разные дозы генов в гетерозиготных диплоидных дрожжевых клетках
Чтобы устранить любые LmSTT3D-зависимые эффекты на N-гликозилирование, мы проверили наши результаты, проанализировав гетерозиготные делеции в диплоидных дрожжевых клетках.Поскольку дрожжевые клетки не имеют механизма обратной связи для контроля уровня белка, делеция одной копии гена в диплоидных клетках снижает уровень белка на 50% (Springer et al. , 2010; Li et al. , 2014). Сниженный уровень активности OST все еще был достаточным для того, чтобы клетки поддерживали N-гликозилирование и выживали. Мы сравнили уровни белка в диплоидных клетках с гетерозиготной делецией в OST1 ( Δost1 / OST1 ) или WBP1 ( Δwbp1 / WBP1 ) с уровнями диплоидных клеток дикого типа.Гетерозиготные диплоидные и диплоидные клетки дикого типа культивировали в среде, содержащей легкие или тяжелые изотопы аргинина и лизина. Мы собрали клетки в экспоненциальной фазе, объединили клетки равного веса и изолировали мембраны, как описано. Белки экстрагировали и переваривали, а пептиды определяли количественно с использованием SRM.
Гетерозиготные делеции OST1 и WBP1 снижали уровни соответствующего белка до ~ 50% по сравнению с клетками дикого типа (). Кроме того, делеция OST1 снижает уровни белков Ost5p, Stt3p, Ost3p и Ost6p, тогда как уровни Wbp1p, Swp1p и Ost2p остаются на уровне ~ 100%.Удаление WBP1 уменьшило количество всех других субъединиц OST. Картина уменьшения субъединицы была такой же, как наблюдаемая в гаплоидных клетках с делецией одной субъединицы и содержащих комплементарный белок LmSTT3D. Мы пришли к выводу, что деградация белка важна для субъединичного гомеостаза белковых комплексов, в частности, в гетерозиготных клетках.
Дозировка генов компонентов OST влияет на стабильность субъединиц в диплоидных дрожжевых клетках. Клетки с делецией гетерозиготной субъединицы ( Δost1 / OST1 = SMA1621, Δwbp1 / WBP1 = SMA1628) выращивали в среде, содержащей легкие аминокислоты (R 0 , K 0 ).Параллельно клетки дикого типа (SMA1620) выращивали в среде, содержащей тяжелые аминокислоты (R 6 , K 8 ). Равные массы клеток, выращенных в тяжелой и легкой средах, объединяли, белки экстрагировали и пептиды готовили для масс-спектрометрии. Отношения легких и тяжелых для всех пептидов OST измеряли с помощью SRM. Численность субъединиц относительно дикого типа рассчитывалась и нормализовалась по рибосомному белку Rpl5p. Уровни субъединиц относительно клеток дикого типа, выращенных в тяжелой среде, отображаются для клеток Δost1 / OST1 (A) и Δwbp1 / клеток WBP1 (B).Среднее значение трех биологических повторов. Планки погрешностей указывают доверительный интервал 95%.
ОБСУЖДЕНИЕ
В этом исследовании мы объединили масс-спектрометрию SILAC и SRM для измерения скорости деградации дрожжевых белков в экспоненциально растущих культурах дрожжей с использованием стандартных лабораторных колб (). Преимущество этого метода заключается в том, что многие белки могут быть проанализированы в одном образце, а с помощью анализов для всего протеома дрожжей под рукой масштаб будущих исследований может быть значительно расширен (Picotti et al., 2013). Использование высокочувствительного метода получения SRM позволило регистрировать скорость деградации белков с промежуточным и низким содержанием, которые не обнаруживаются с помощью подходов SILAC с дробовиком MS, потенциально до 50 копий на клетку (Picotti et al. , 2009). Более того, воспроизводимые и согласованные данные, полученные с помощью SRM, особенно полезны в экспериментах с отслеживанием импульсов, в которых определенный набор пептидов отслеживается в течение нескольких временных точек. В отличие от экспериментов MS, зависящих от данных, в которых часто отсутствуют точки данных из-за разной интенсивности пиков и совместного элюирования пептидов, количество точек данных, собранных для каждого элюируемого пептида, намного выше, что приводит к более точным данным для количественной оценки.Таким образом, мы демонстрируем, что подход SILAC-SRM является чувствительным и надежным методом для измерения скорости деградации белков со средним и низким содержанием и для мониторинга стабильности белковых комплексов.
Мы измерили период полураспада дрожжевого белка в диапазоне времени от 20 минут до многих часов. Большинство белков в дрожжевых клетках дикого типа имели очень низкие скорости разложения и период полураспада> 12 часов (и). Лишь небольшое количество белков показало период полураспада <12 часов, и эти результаты согласуются с предыдущими результатами по дрожжам, показывающими, что проанализированные белки дикого типа были стабильными (Futcher et al., 1999; Xie et al. , 2009). Кроме того, в двух исследованиях с использованием SILAC в сочетании с МС с дробовиком сообщалось о длительном среднем или среднем периоде полураспада белка, составляющем 32 и 11 часов в культурах хемостатных дрожжей, выращенных при ограничении питательных веществ (Pratt et al. , 2002; Helbig et al. , 2011). Низкие уровни деградации белка или длительные средние периоды полураспада (от 2 до 9 дней) были также обнаружены для других видов, включая Escherichia coli , фибробласты мыши и клетки мозга мыши (Larrabee et al., 1980; Цена и др. , 2010; Schwanhausser et al. , 2011). Вместе эти данные предполагают, что гомеостаз белков в основном регулируется посредством синтеза. Действительно, два недавних исследования показали, что в E. coli и клетках млекопитающих изобилие белка в основном контролируется на уровне трансляции, сводя к минимуму потребность в деградации избыточного белка (Schwanhausser et al. , 2011; Li et al. , 2014). Отсутствие деградации имеет особое значение для белковых комплексов и означает, что скорость синтеза коррелирует со стехиометрией субъединицы.Действительно, недавнее исследование (Li et al. , 2014) и наши результаты подтверждают эту гипотезу.
Тем не менее, система ERAD настроена на деградацию избыточных субъединиц, как мы показали для сверхэкспрессированных субъединиц OST (и). Обнаружение того, что субъединицы утилизируются с белково-специфической скоростью, можно объяснить белково-специфическими взаимодействиями с механизмом ERAD. С другой стороны, удаление существенных субъединиц OST дестабилизировало комплекс и приводило к деградации субъединиц (). Это предполагает, что в отсутствие их партнеров по связыванию субъединицы могут быть термодинамически нестабильными или подвергать сигналы деградации, нацеленные на них для ERAD.Поэтому мы предполагаем, что OST дестабилизируется делецией субъединицы, но не сверхэкспрессией, и что этот принцип может применяться ко многим дрожжевым белковым комплексам. Такая «кооперативная стабильность» была описана для нескольких гетеромерных и гомомерных комплексов у дрожжей и других организмов (Johnson et al. , 1998; Asher et al. , 2006; Daley, 2008). В соответствии с этим сценарием сверхэкспрессированные отдельные субъединицы белковых комплексов деградировали в анеуплоидных дрожжевых клетках (Dephoure et al., 2014). Эта сложная модель стабильности также подразумевает, что функция белкового комплекса является устойчивой перед лицом крупномасштабных дупликаций генов, поскольку сверхэкспрессия одной субъединицы не влияет на активность фермента и одновременное дублирование всех локусов субъединицы маловероятно. Следовательно, организация ферментов в виде комплексов обеспечивает постоянную активность ключевых процессов, таких как N-гликозилирование или синтез белка, независимо от анеуплоидии или гетерозиготности.
Мы количественно определили относительные уровни субъединиц в клетках, удаленных в одной из субъединиц OST, относительно дикого типа и вывели последовательность событий для сборки комплекса OST (и).В соответствии с предыдущими исследованиями, Wbp1p, Swp1p и Ost2p образуют один субкомплекс (субкомплекс 1 в; Silberstein et al. , 1995; Karaoglu et al. , 1997; Kelleher and Gilmore, 1997; Spirig et al. , 1997). Сходным образом Ost1p и Ost5p связываются друг с другом и вместе с Stt3p образуют другой субкомплекс (субкомплексы 2a и 2b). Предыдущие исследования показали генетические и биохимические взаимодействия Ost1p и Ost5p и предположили, что эти белки образуют субкомплекс (Reiss et al., 1997; Ян и др. , 2003). Однако, поскольку делеция Ost5p не делает ни Ost1p, ни Stt3p нестабильными, возможно, что Ost5p имеет второстепенное значение для стабильности этого субкомплекса и составляет вспомогательную субъединицу (). На следующем этапе подкомплексы 1 и 2 взаимодействуют с образованием следующего промежуточного соединения сборки. Впоследствии Ost4p связывается с Stt3p и закрепляет Ost3p или Ost6p в комплексе OST (Spirig et al. , 1997, 2005). По сравнению с предыдущими исследованиями, эта модель расширяет наши знания об архитектуре OST и противоречит предложенному субкомплексу Stt3p-Ost4p-Ost3p / Ost6p (например, Heesen et al., 1993; Караоглу и др. , 1997; Reiss et al. , 1997; Spirig et al. , 1997, 2005; Schwarz et al. , 2005; Nasab et al. , 2008). Основываясь на наших результатах, наблюдаемые субкомплексы являются промежуточными продуктами сборки, которые имеют более низкую стабильность, чем полностью собранный OST, но придают стабильность мономерам субъединиц. Помимо их ферментативных свойств, важной функцией субъединиц OST является обеспечение стабильности комплекса. Это свойство необходимо учитывать при использовании обратных генетических инструментов для функциональных исследований.
Модель для подкомплексов OST и сложной сборки. Wbp1p, Ost3p и Swp1p образуют подкомплекс 1. Ost1p стабилизируется Ost5p и образует подкомплекс 2 с Stt3p. Вместе с Ost4p эти два подкомплекса образуют подкомплекс 3. Затем Ost4p прикрепляет Ost3p или Ost6p к окончательному комплексу. Субъединицы окрашены в зеленый, желтый или оранжевый цвет согласно Kelleher and Gilmore (2006). Графические схемы не отражают фактические сайты взаимодействия между подразделениями.
Если большинство клеточных белков стабильны и общий оборот очень низкий, какова функция ERAD в дрожжевых клетках? Очевидно, что ERAD необходим для избавления от неправильно свернутых белков.Кроме того, наши результаты показывают, что ERAD регулирует уровни белков, которые нестабильны из-за стехиометрического дисбаланса, предотвращая их агрегацию. Дисбаланс белков может быть временным из-за измененных условий роста (например, экспоненциальный рост по сравнению с ростом в условиях ограничения углерода), и ERAD становится важным в этих условиях. В самом деле, экспрессия компонентов ERAD увеличивается при воздействии сигналов внешнего и внутреннего стресса (Travers et al. , 2000). Конститутивный дисбаланс белков может быть результатом генетических событий, таких как дупликация гена или гетерозиготность (Chang et al., 2013; Магадум и др. , 2013). В этих условиях деградация белка имеет решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток (Torres et al. , 2007, 2010; Dephoure et al. , 2014). Интересно, что такие генетические изменения являются основой для развития новых свойств; это было бы невозможно без механизма, который регулирует гомеостаз белка путем деградации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реагенты
Антитела, использованные в исследовании, перечислены в дополнительной таблице S2.Аргинин 13 C 6 был получен из Cambridge Isotope Laboratories, Тьюксбери, Массачусетс; 13 C 6 — 15 N 2 лизин был от Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
Плазмиды и штаммы дрожжей
Плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S3. Плазмиды были сконструированы с использованием стандартных протоколов клонирования.
pPrA: открытая рамка считывания (ORF) PEP4 и ее природные промоторные и терминаторные области вырезали из PEP4 -pRS316 рестрикционным гидролизом с Sal I и Bam HI.Фрагмент ДНК лигировали с расщепленным YEp352 Sal I / Bam HI.
pLmSTT3D-URA: pRS426-GPD-LmSTT3D расщепляли Sac I и Eco RV с получением фрагмента ДНК, который включал промотор GPD, ORF Lm STT3D и терминаторную область CYC1 . Фрагмент ДНК лигировали с расщепленным YEp352 Sac I / Eco RV.
Использовались стандартные генетические методы дрожжей (Guthrie and Fink, 1991; Wach et al., 1994; Guldener et al. , 1996). Штаммы дрожжей, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S4.
Иммуноблот-анализ
Культуры выращивали в подходящей синтетической выпадающей (SD) среде до экспоненциальной фазы. Клетки лизировали стеклянными шариками в буфере для образцов (2% SDS, 62,5 мМ Трис / HCl, pH 6,8, 10% глицерин, 6 М мочевина, 5% β-меркаптоэтанол, 0,02% бромфенолового синего, ингибитор протеазы [Complete; Roche], 5 мМ фенилметилсульфонилфторид, 25 мМ EDTA) встряхиванием при 4 ° C в течение 15 мин.Белки растворяли при 37 ° C в течение 20 мин. Равные количества белка загружали в 10% полиакриламидные гели. Белки наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану гибридизовали с первичным антителом, промывали и гибридизовали с соответствующими вторичными антителами. Белки обнаруживали с помощью раствора ECL (GE Healthcare, Amersham) и светочувствительных пленок (Super RX, Fuji Medical X-Ray Film; Fuji, Tokyo, Japan).
SILAC chase Experiment
Клетки дрожжей выращивали до экспоненциальной фазы (OD 600 = 1) в соответствующей среде SD с добавлением 20 мг / л тяжелых изотопов аргинина ( 13 C 6 ) и лизина ( 13 C 6 — 15 N 2 ).Клетки собирали фильтрованием, промывали средой SD без аргинина и лизина и ресуспендировали в среде SD, содержащей легкие изотопы аргинина и лизина, с получением OD 600 = 0,5. В указанные моменты времени собирали 50 OD клеток, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.
Пробоподготовка для масс-спектрометрии
Клетки лизировали стеклянными шариками в 2 M NaCl, 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновой кислоте (HEPES) / NaOH, pH 7.4, 1 мМ ЭДТА и ингибиторы протеазы (Complete; Roche Diagnostics International AG, Rotkreuz, Швейцария) при 4 ° C в течение 15 мин. Лизат очищали (1000 × g, , 5 мин), и микросомальные фракции собирали центрифугированием при 16000 × g и 4 ° C в течение 20 минут. Микросомы ресуспендировали погружением и обработкой ультразвуком в 1 мл 0,1 М Na 2 CO 3 и 1 мМ ЭДТА, pH 11,3 и инкубации при 4 ° C в течение 30 мин. Микросомы осаждали и отделяли от супернатанта.Супернатант в количестве 500 мкл осаждали 55 мкл трихлоруксусной кислоты на льду в течение 5 мин, и осадок дважды промывали ацетоном. Микросомы один раз промывали 1 мл 5 М мочевины, 100 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, pH 7,4 и 1 мМ EDTA, и дважды 1 мл 0,1 М трис / HCl, pH 7,6. Наконец, все образцы солюбилизировали в 100-200 мкл 4% SDS, 50 мМ дитиотреитола (DTT) и 0,1 М трис / HCl, pH 7,6, и раствор очищали центрифугированием.
Белки обрабатывали с использованием протокола подготовки проб с фильтрацией (Wisniewski et al., 2009). Образцы разбавляли в 20 раз буфером UA (8 М мочевина, 0,1 М трис / HCl, pH 8,5) и наносили на устройство с отсекающим фильтром 30 кДа (Amicon; Millipore, Billerica, MA). После промывки 0,4 мл УК белки алкилировали в 0,2 мл 50 мМ йодацетамида в течение 30 мин в темноте. Белки трижды промывали 0,4 мл UB (8 M мочевина, 0,1 M трис / HCl, pH 8,0) и ресуспендировали в 60 мкл UB. Белки расщепляли 2 мкг эндопротеиназы Lys-C (Wako Pure Chemical, Richmond, VA) в течение 16 часов, разбавляли 400 мкл 40 мМ NaHCO 3 и расщепляли 2 мкг трипсина при 37 ° C в течение 4 часов. .Пептиды элюировали и определяли концентрацию пептидов. Пептиды в количестве 5 мкг разводили трифторуксусной кислотой до конечной концентрации 3% ацетонитрила и pH 2–3. Наконец, образцы обессоливали с помощью наконечника C18 ZipTips (Millipore).
Разработка анализа SRM
Протеотипические пептиды были отобраны для 26 белков (включая 25 белков-мишеней и белок Rpl5p) с использованием BLAST и PeptideAtlas. Большинство переходов (66 из 83 целевых пептидов) были извлечены из SRM-атласа с использованием сборки спектральной библиотеки дрожжей «201207_QQQ_lib.tgz », описанный Picotti et al. (2013). Для других пептидов мы использовали ионы из прогонов QTRAP или LTQ Orbitrap или теоретических переходов. Время удерживания определялось незапланированными прогонами SRM или было перенесено из предыдущих прогонов LTQ Orbitrap с использованием пептидов Biognosys iRT и линейной экстраполяции. Было проанализировано несколько пептидов на белок и до 10 переходов / предшественник. Все пики проверялись вручную на предмет правильности назначения и точного интегрирования пиков. Пик предшественника идентифицировали путем соэлюции переходов, соответствующего содержания пептидов, относительной интенсивности фрагментов легких и тяжелых предшественников в образцах SILAC, а также времени удерживания и сравнения со спектральной библиотекой (скалярный продукт> 0.7; Picotti et al. , 2013). Для окончательного метода были выбраны четыре или пять переходов, показывающих наиболее интенсивные сигналы, наибольшую избирательность и наименьший фон или помехи для каждого предшественника. Для 25 белков-мишеней и Rpl5p мы составили список из 83 пептидов и 982 переходов (дополнительная таблица S1). Для 43 пептидов переходы были подтверждены с использованием синтетических пептидов (SpikeTides; JPT, Берлин, Германия). Кроме того, переходы для некоторых пептидов тестировали путем измерения дрожжевых клеток, в которых соответствующий белок был сверхэкспрессирован или отсутствовал из-за делеции (дополнительная таблица S1).
Масс-спектрометрия SRM
Время удерживания Пептиды iRT (Biognosys, Schlieren, Швейцария) добавляли ко всем образцам в соотношении 1: 20–1: 40. Для каждого образца 2-8 мкл вводили в колонку с нано-фриттой (15 см × 75 мкм; OD 375 мкм; шарики, Magic C18 AQ, 3 мкм, 200 Å; Bischoff Chromatography, Леонберг, Германия), соединенную с распылителем. наконечник (излучатель PicoTip, FS360-20-10-N-20-C12; New Objective; MS Wil, Wil, Швейцария), соединенный с Eksigent nanoLC-Ultra 1D plus (ABSciex, Цуг, Швейцария).Колонку поддерживали при 50 ° C. Пептиды элюировали с использованием градиента от 3 до 35% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты в воде в течение 57,5 мин и скорости потока 500 нл / мин.
Целевой анализ SRM был выполнен на приборе QTRAP 5500 (AB Sciex), оборудованном источником ионов с нанораспылением. Запланированные запуски SRM были выполнены в режиме положительных ионов. Температура границы раздела составляла 170 ° C, напряжение распыления ионов составляло 2000–2500 В, давление газа источника ионов составляло 6–10 фунтов на квадратный дюйм, давление газа завесы составляло 25 фунтов на квадратный дюйм, а газ для столкновения был установлен на высокое значение.Потенциал декластеризации имел значение 100, потенциал выхода из коллизионной ячейки 13 и входной потенциал 10. Дальнейшими настройками были единичное разрешение для Q1 и Q3 и пауза в 2 мс между диапазонами масс, 5-минутные окна времени удерживания для переходов и время сканирования цели 3 с. Результаты запланированных прогонов SRM были экспортированы в Skyline, а пики были интегрированы (MacLean et al. , 2010). Пики проверялись вручную на предмет правильного назначения и точного интегрирования пиков.
Расчет скорости деградации белка
Скорость потери старого белка из клетки ( k LOSS ) рассчитывалась из динамики изотопных соотношений в соответствии с Larrabee et al. (1980). Значения были нормализованы к разбавлению содержания белка путем деления клеток. Это было сделано путем вычитания k DI L (= k LOSS стабильного эталонного белка Rpl5p). Наконец, период полураспада был рассчитан как t 1/2 = ln (2) / k DEG .
Приготовление экстрактов целых клеток и масс-спектрометрический анализ с дробовиком
Эквивалент 50 клеток OD лизировали стеклянными шариками в 100 мМ трис-HCl, pH 7.6, 50 мМ DTT и 4% SDS. Лизаты были очищены, а ДНК разрезана ультразвуком. 200 мкг белка разбавляли 400 мкл буфера UA (8 М мочевина в 0,1 М трис-HCl, pH 8,5) и готовили для масс-спектрометрии, как описано. Пептиды времени удерживания Biognosys iRT добавляли к образцам в соотношении 1:40. Количество 4 мкл анализировали на LTQ Orbitrap Velos (Thermo Scientific, Бремен, Германия) с использованием обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с градиентом вода / ацетонитрил 1–35% ацетонитрила при скорости потока 250 нл / мин.Циклы были получены с использованием стандартной программы жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС / МС) из одного обзора (МС с преобразованием Фурье), за которым следовали 20 сканирований, зависящих от данных ионной ловушки (МС / МС), повторяющихся на протяжении всего цикла. Обзорные сканы (300–1700 м / z ) были получены в профильном режиме с разрешением 60 000 на 400 м / z . Фрагментация диссоциации, вызванная столкновением, была выполнена с использованием нормированной энергии столкновения 35, энергии активации 0.25, а время активации 10 мс. Было применено динамическое исключение 90-х годов с размером списка максимум 500 записей. Пептиды были количественно определены, а белки идентифицированы с использованием программного обеспечения MaxQuant (Cox and Mann, 2008).
Стационарный эксперимент SILAC-SRM
Равные массы клеток дикого типа, выращенных в тяжелых и мутантных клетках в легкой среде, смешивали в соотношении 1: 1. Были приготовлены образцы, и сигналы предшественников легкого (L) и тяжелого (H) были измерены с помощью SRM, как описано. Для каждого пептида рассчитывали отношения L / H.Количество субъединиц OST относительно дикого типа рассчитывали из среднего L / H по всем пептидам белка. Значения нормализовали путем деления на рибосомный контрольный белок Rpl5p или на среднее значение L / H всех белков, не относящихся к OST (SEC, белки PMT и Pdr5p) в каждой реплике.
Руководство по оценке затрат на передовые технологии ядерной энергетики (Технический отчет)
Делен, Дж. Г., и Хадсон, II, К. Р. Руководство по оценке затрат на передовые технологии ядерной энергетики .США: Н. П., 1993.
Интернет. DOI: 10,2172 / 10176857.
Делен, Дж. Г., & Хадсон, II, К. Р. Руководство по оценке затрат на передовые технологии ядерной энергетики . Соединенные Штаты. https://doi.org/10.2172/10176857
Делене, Дж.G., and Hudson, II, C. R. Sat.
«Методические указания по смете перспективных технологий атомной энергетики». Соединенные Штаты. https://doi.org/10.2172/10176857. https://www.osti.gov/servlets/purl/10176857.
@article {osti_10176857,
title = {Руководство по оценке затрат на передовые технологии ядерной энергетики},
author = {Делин, Дж.G. and Hudson, II, C. R.},
abstractNote = {В настоящее время разрабатываются несколько передовых концепций электростанций. К ним относятся модульные высокотемпературные реакторы с газовым охлаждением, усовершенствованный жидкометаллический реактор и усовершенствованные легководные реакторы. Одним из критериев привлекательности новой концепции является ее стоимость. Неизменно стоимость нового типа электростанции будет сравниваться с другими альтернативными формами производства электроэнергии. Этот отчет представляет собой общую отправную точку, посредством которой сметы затрат на различные рассматриваемые электростанции разрабатываются с использованием общих допущений и основных правил.Тогда сравнения можно будет проводить на постоянной основе. Это второе обновление настоящих рекомендаций по оценке затрат. Внесены изменения, чтобы сделать руководство более актуальным (1 января 1992 г.) и в ответ на предложения, сделанные в результате использования предыдущего отчета. Основные изменения заключаются в том, что справочный сайт был изменен с типового сайта Северо-Востока (Мидлтаун) на более центральный сайт (Восточный / Западный центральный сайт EPRI), и были добавлены справочные цены на оптовые товары и показатели производительности труда.Этот отчет призван обеспечить основу для подготовки и отчетности о затратах. Смета затрат будет состоять из затрат на строительство в одночасье, общих капитальных затрат на установку, затрат на эксплуатацию и техническое обслуживание, затрат на топливо, затрат на вывод из эксплуатации и затрат на производство электроэнергии или сборных шин.},
doi = {10.2172 / 10176857},
url = {https://www.osti.gov/biblio/10176857},
журнал = {},
номер =,
объем =,
place = {United States},
год = {1993},
месяц = {5}
}
Пограничная стена Трампа будет самой дорогой в мире: NPR
Новый участок пограничной стены виден в ноябре 2019 года к югу от Донны, штат Техас.Ожидается, что пограничная стена Трампа протяженностью 576 миль будет стоить почти 20 миллионов долларов за милю, что дороже, чем любая другая стена, строящаяся в мире. Вероника Дж. Карденас для NPR скрыть подпись
переключить подпись Вероника Дж. Карденас для NPRНовый участок пограничной стены в ноябре 2019 года к югу от Донны, штат Техас.Ожидается, что пограничная стена Трампа протяженностью 576 миль будет стоить почти 20 миллионов долларов за милю, что дороже, чем любая другая стена, строящаяся в мире.
Вероника Дж. Карденас для NPRЦена на пограничную стену президента Трампа превысила 11 миллиардов долларов, или почти 20 миллионов долларов за милю, чтобы стать самой дорогой стеной такого рода в мире.
В отчете о состоянии дел на прошлой неделе Служба таможенного и пограничного контроля США, осуществляющая надзор за строительством стен, сообщила, что с тех пор, как Трамп вступил в должность, на строительство 576 миль новой «системы пограничных стен» было выявлено 11 миллиардов долларов.
И администрация Трампа ищет финансирование, чтобы построить еще больше. Министерство внутренней безопасности обратилось к Министерству обороны с просьбой выделить деньги на строительство 270 дополнительных миль пограничной стены, которая, по утверждению DHS, необходима для блокирования маршрутов контрабанды наркотиков на федеральных землях.Пентагон изучает запрос, в котором не было долларовой суммы.
Если администрация Трампа завершит все возведенные ею стены, три четверти южной границы США будут отгорожены от Мексики. Правительство унаследовало около 650 миль пограничных сооружений, построенных президентами Джорджем Бушем и Бараком Обамой.
«У вас будет стена, как никакая другая. Это будет мощная, потрясающая стена», — сказал президент Трамп на митинге в Милуоки на прошлой неделе.«Очень большая и очень мощная пограничная стена возводится с рекордной скоростью, и теперь мы полностью профинансированы, не правда ли?»
Чтобы понять, почему правительство так много тратит на строительство пограничной стены Трампа, взгляните на строительные площадки в долине Рио-Гранде в Техасе.
С одной стороны дороги Каличе виднеется пешеходный забор, возведенный более десяти лет назад.На высоте 18 футов он выглядит совершенно ничтожным. На другой стороне дороги массивные стальные болларды, увенчанные «пластиной, препятствующей лазанию», которые возвышаются на 30 футов над хлопковыми полями в окружении людей в касках и тяжелом снаряжении.
Забор Буша стоил в среднем 4 миллиона долларов за милю; Стена Трампа стоит в пять раз больше — 20 миллионов долларов за милю. Общая стоимость в 11 миллиардов долларов приближается к цене атомного авианосца.
Представитель Службы таможенного и пограничного контроляКристиан Альварес отмечает, что барьер Трампа намного больше.
«Система пограничных стен будет включать 150-футовую охранную зону, освещение, камеры, другие технологии и, самое главное, всепогодную подъездную дорогу, которая облегчит реагирование на движение (иммигрантов без документов)», — сказал Альварес. «Так что это не просто сам барьер».
В 30-футовой конструкции больше стали — дорогой товар. Кроме того, здесь есть мощные прожекторы, и на каждой миле будет проводка для электроэнергии и оптоволокно, соединяющее камеры наблюдения.Электронные ворота, позволяющие пройти через стену, стоят до 1 миллиона долларов за штуку. И есть градуированная, засыпанная гравием зона контроля шириной с шестиполосное шоссе.
«Система пограничных стен будет включать 150-футовую охранную зону, освещение, камеры, другие технологии и, самое главное, всепогодную подъездную дорогу, которая облегчит реагирование на движение транспорта», — говорит Кристиан Альварес, представитель пограничного патруля. Вероника Г.Карденас для NPR скрыть подпись
переключить подпись Вероника Дж. Карденас для NPR«Система пограничных стен будет включать 150-футовую охранную зону, освещение, камеры, другие технологии и, самое главное, всепогодную подъездную дорогу, облегчающую реагирование на движение транспорта», — говорит Кристиан Альварес, представитель пограничного патруля.
Вероника Дж. Карденас для NPRПограничная стена Трампа сейчас самая высокая и самая дорогая в мире, сказал Рис Джонс, географ из Гавайского университета, изучающий пограничные стены.
«Стоимость почти 20 миллионов долларов за милю в четыре раза больше, чем стоимость самых дорогих других возводимых стен», — сказал Джонс.
Пограничные стены очень популярны в эпоху после холодной войны, сказал он, и сейчас их по крайней мере 60 по всему миру.Стена Израиля на Западном берегу занимает второе место по дороговизне — от 1 до 5 миллионов долларов за милю.
Конгресс выделил средства на строительство стены в долине Рио-Гранде, но теперь правительство заявляет, что ему нужно больше. CBP вкладывает 600 миллионов долларов в Фонд конфискации казначейства, в котором хранятся деньги, конфискованные в ходе уголовных расследований.
Часть дополнительных денег будет потрачена на возведение стены выше и на 10 миль длиннее. Также имело место «увеличение стоимости проекта из-за непредвиденных условий на площадке», а именно серьезных проблем с фильтрацией, когда стена дамбы пересекает канал, который впадает в Рио-Гранде.
Об этих дополнительных расходах стало известно из недавних показаний, сделанных Лореном Флоссманом, начальником стены CBP. Он также сказал, что агентству нужно больше денег, чтобы покрыть огромные расходы на приобретение полос частной собственности под стеной.
Захват частной земли через выдающиеся владения затрагивает несколько агентств, включая Министерство юстиции, и может привести к судебным искам. Этот процесс «значительно увеличивает препятствия, с которыми приходится сталкиваться правительству», — сказал Скотт Никол, давний противник стены с Sierra Club в долине Рио-Гранде.
«Если у вас есть частная собственность, и правительству приходится обращаться в суд, чтобы получить эту собственность, это занимает намного больше времени и увеличивает стоимость, потому что вы должны платить за эту землю», — сказал Николь. «Вы должны послать юристов Министерства юстиции, чтобы получить эту землю».
К середине января правительство построило 101 милю пограничной стены. Сотня миль от этого — замена или второстепенная стена; только одна миля была построена там, где раньше не существовало никаких преград.
Вопреки заявлениям президента Трампа, стена не «поднимается с рекордной скоростью.«Фактически, строительство отстает от графика на несколько месяцев из-за сложности приобретения частной земли в Южном Техасе.
Реализуемые в настоящее время масштабные проекты строительства стен полностью профинансированы, в первую очередь из-за готовности президента обойти дерзкий Конгресс.
За последние два бюджетных цикла контролируемая демократами Палата представителей выделила 2,75 миллиарда долларов на строительство стены — намного меньше, чем просил Трамп.Поэтому Трамп закрыл правительство, объявил чрезвычайное положение и отвел миллиарды долларов из Министерства обороны на оплату его стены.
Проиммигрантские группы незамедлительно подали в суд, и сначала им удалось добиться от федерального правительства запрета на финансирование строительства стены военными. Но консервативное большинство как в Верховном суде США, так и в федеральном апелляционном суде Нового Орлеана отменили судебные запреты и позволили администрации продолжить строительство.
«Я имею в виду, при всем уважении к президенту, он одержим этой стеной», — сказал представитель.Генри Куэльяр, демократ из Ларедо, штат Техас, член комитета по ассигнованиям палаты представителей. «Это предвыборное обещание, и что случилось с тем, что Мексика заплатила за это?»
Демократы говорят, что они действительно хотят безопасности границ, но для этого нужны людские ресурсы и технологии, а не сталь и бетон.
«Я живу на границе. Я не хочу видеть хаос. Я хочу видеть закон и порядок на границе», — продолжил Куэльяр.«Но я не хочу просто тратить миллиарды долларов на этих федеральных подрядчиков».
Федеральные подрядчики — это в основном строительные компании-гиганты, имеющие опыт реализации сложных федеральных проектов.
Тогда есть песок и гравий Fisher. Компания из Северной Дакоты заключила контракт на строительство стены на 400 миллионов долларов после того, как генеральный директор Томми Фишер выступил на Fox News — канале, который часто смотрит Трамп, — чтобы похвастаться, как он может построить стену быстрее и дешевле на границе с Калифорнией.
«Так что нынешний забор, который они строят прямо сейчас в Калексико, правительству дано в основном 300 дней на строительство двух миль. С одной бригадой мы можем построить 15 миль за один год», — сказал Фишер интервьюеру Fox.
Сейчас генеральный инспектор Пентагона рассматривает контракт. Аудиторы хотят знать, довел ли Белый дом дело до Фишера, который считает, что его предложение было наилучшим.
УСТРАНЕНИЕ НЕИСПРАВНОСТЕЙ: Брошенные дети в Steam
Об этой игре
Все, что может быть SRPGTROUBLESHOOTER: Abandoned Children — это первый сезон пошаговой стратегии SRPG, действие которой происходит в мире Troubleshooter. Валгалла, нестабильная нация Валгалла — страна свободной торговли, созданная тремя мировыми державами для собственной выгоды после мировой войны. Пытаясь контролировать нацию, три мировые державы запретили армию покинуть Валгаллу. Из-за этих обстоятельств общественный порядок в Валгалле всегда нестабилен, и поэтому спустя десять лет правительство Валгаллы приняло смелое решение. Рождение средства устранения неполадок Правительство Валгаллы предоставило гражданским лицам право расследовать и арестовывать преступников, чтобы снизить рост преступности.Люди называют их средством устранения неполадок. Начало вашей и всех остальных историй Прошло 10 лет с момента внедрения системы устранения неполадок. Альбус, 20-летний молодой человек, становится официальным специалистом по устранению неполадок. Альбус сначала основал свою компанию самостоятельно, но вскоре у него появилось много коллег, поскольку он решал все больше дел. У всех этих новых членов компании есть свои мотивы и истории. Вы будете проходить различные миссии в Валгалле через их истории. Специализированные классы. Более 600 мастерств. Более 200 дополнительных навыков У всех персонажей в Troubleshooter есть свои уникальные классы. Каждый персонаж может подняться до высшего класса, и роль вашего персонажа меняется в зависимости от класса.
Все персонажи в Troubleshooter могут приобретать различные навыки в соответствии со своими уровнями и классами. Кроме того, вы можете активировать дополнительные эффекты комбинациями умений. Используя это, вы можете создать персонажа для своей уникальной стратегии.
Такое мастерство можно получить, повышая уровень своего персонажа. Однако в большинстве случаев вы можете получить мастерство от врагов. Другими словами, вы можете взять уникальные черты своих врагов и применить их к своим персонажам.
Более 80 уникальных миссий В Troubleshooter более 80 уникальных миссий. Все миссии разрабатываются независимо, и все они имеют свои уникальные обстоятельства. Более 200 уникальных кат-сцен Средство устранения неполадок использует более 200 кат-сцен для изображения сюжета. Творческий потенциал SRPG может иметь По мере того, как новые персонажи присоединяются к вашей компании, игровой контент будет разблокирован в соответствии с их ролями. Например, если вы наймете персонажа-охотника, вы сможете приручить зверей. Вы сможете создавать дронов, если наберете инженеров. На что следует обратить внимание перед покупкой ※ Мы поддерживаем автономный режим, который предназначен для тех, у кого нестабильное интернет-соединение.※ Мультиплеерный контент будет добавляться постоянно, и для безопасной и честной информации пользователей нам требуется ваше подключение к Интернету в онлайн-режиме.
