Пентаплекс что это: Что такое пентаплекс?

Предполагаемое использование:

Качественное обнаружение бактерий, S. cerevisiae var. diastaticus и Dekkera spp. загрязнения в фильтрованном пиве, пивных смесях и образцах, содержащих дрожжи.

Общая информация:

Аппарат для ПЦР в реальном времени для высокопрофильных пробирок для ПЦР (ATTO, FAM, HEX, ROX, Cy5)

Принадлежности:

QuickGEN Pentaplex PCR Kit — Скрининг бактерий порчи пива и дрожжейr-biopharm.com/wp-content/uploads/2021/06/microsoftteams-image.jpg200px200px

Подобные продукты

Дрожжи GEN-IAL® QuickGEN Sam …

Микробная ДНК-экстракция из образцов с большим количеством дрожжевых клеток, например резервуары для дрожжей, размножение и т. д.

GEN-IAL® QuickGEN P1 Screen …

Качественное определение бактериального загрязнения и генов устойчивости хмеля гор А и гор С как генетических маркеров микроорганизмов, вызывающих порчу пива…

GEN-IAL® QuickGEN P1 and S ….

Качественное обнаружение бактерий и S. cerevisiae var. diastaticus в фильтрованном пиве, пивных смесях и образцах, содержащих дрожжи.

Поддержка продуктов

Вопросы? Воспользуйтесь опытом нашей команды. Мы здесь, чтобы поддержать вас и ваш бизнес на протяжении всего процесса тестирования, чтобы обеспечить ваш успех.

Начните вводить и нажмите Enter для поиска

EuroProxima Nortestosterone

EuroProxima Этинилэстрадиол

Мы используем файлы cookie на нашем веб-сайте. Некоторые из них очень важны, а другие помогают нам улучшить этот веб-сайт и улучшить ваш опыт.

Принять все

Сохранить

Индивидуальные настройки конфиденциальности

Подробная информация о файлах cookie Политика конфиденциальности Отпечаток

Здесь вы найдете обзор всех используемых файлов cookie.Вы можете дать свое согласие на использование целых категорий или отобразить дополнительную информацию и выбрать определенные файлы cookie.

Оптимизированная ПЦР Pentaplex для обнаружения колоректального рака с недостаточностью восстановления несоответствия ДНК

Абстрактные

Назначение

Микросателлитная нестабильность (MSI) используется для скрининга колоректального рака (CRC) на синдром Линча, а также для прогнозирования результатов и реакции на лечение.Текущий метод измерения MSI требует ДНК из нормальных и неопластических тканей и не может идентифицировать опухоли со специфическими дефектами репарации несоответствия ДНК (MMR). Мы протестировали панель из пяти маркеров квазимономорфных мононуклеотидных повторов, амплифицированных в одной мультиплексной реакции ПЦР (пентаплексная ПЦР) для обнаружения MSI.

Опытный образец

Мы исследовали когорту из 213 пациентов с CRC, состоящую из 114 опухолей с дефицитом MMR и 99 опухолей с высоким уровнем MMR. Иммуногистохимический (ИГХ) анализ оценивал экспрессию MLh2, MSh3, PMS2 и MSH6.Статус MSI определялся различиями в диапазоне квазимономорфных вариаций (QMVR) из пула нормальных образцов ДНК и измерением различий в длинах аллелей в опухолевой ДНК.

Результаты

Амплификация 426 нормальных аллелей позволила оптимизировать QMVR для каждого маркера и устранила требование сопоставленной эталонной ДНК для определения MSI в каждом образце. Использование ≥2 / 5 нестабильных маркеров в качестве критериев для MSI привело к чувствительности 95,6% (95% ДИ = 90,1–98,1%) и положительной прогностической ценности 100% (95% ДИ = 96.6% –100%). Выявление дефицита MSH6 было ограничено всеми методами. Анализ данных с помощью панели из трех маркеров (BAT26, NR21 и NR27) был сопоставим по чувствительности (97,4%) и положительной прогностической ценности (96,5%) с панелью из пяти маркеров. Оба подхода превосходили стандартный подход к измерению MSI.

Выводы

Оптимизированная пентаплексная (или триплексная) ПЦР предлагает простой, надежный, очень недорогой, высокочувствительный и специфический анализ для идентификации MSI в CRC.

Образец цитирования: Goel A, Nagasaka T., Hamelin R, Boland CR (2010) Оптимизированная ПЦР Pentaplex для обнаружения колоректального рака с недостаточностью восстановления несоответствия ДНК. PLoS ONE 5 (2): e9393. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009393

Редактор: Джозеф Найбауэр, Национальный медицинский центр «Город надежды», Соединенные Штаты Америки

Поступила: 3 ноября 2009 г .; Одобрена: 3 февраля 2010 г .; Опубликовано: 24 февраля 2010 г.

Авторские права: © 2010 Goel et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Настоящая работа поддержана грантами RO1 CA 72851 (для CRB) и RO1 CA 129286 (для AG и CRB) от Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения и средств Исследовательского института Бейлора. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Микросателлитная нестабильность (MSI), которая определяется как накопление инсерционно-делеционных мутаций в коротких повторяющихся последовательностях ДНК (или «микросателлитах»), является характерной чертой раковых клеток с дефицитом репарации несоответствия ДНК (MMR) [1] . Инактивация любого из нескольких генов MMR, включая MLh2 , MSh3 , MSH6 и PMS2 , может привести к MSI.Первоначально было показано, что MSI коррелирует с дефектами зародышевой линии в генах MMR у пациентов с синдромом Линча (LS), где> 90% пациентов с колоректальным раком (CRC) обнаруживают MSI [2], [3]. Позже было установлено, что MSI также встречается в ~ 12% спорадических CRC, встречающихся у пациентов, у которых отсутствуют мутации MMR зародышевой линии, и MSI у этих пациентов возникает из-за индуцированного метилированием промотора подавления экспрессии гена MLh2 [4]. Определение статуса MSI при CRC имеет клиническое применение для выявления пациентов с дефектами зародышевой линии, предрасполагающими к дефициту MMR.Кроме того, статус MSI имеет прогностическое и терапевтическое значение, потому что CRC MSI обычно имеют лучший прогноз, и эти виды рака менее чувствительны к адъювантной химиотерапии на основе 5FU [5].

С момента своего первого открытия более десяти лет назад методы и критерии для определения MSI в CRC постоянно развивались. Однако до сих пор нет единого мнения об использовании различных анализов MSI, которые являются более надежными, недорогими и могут привести к анализу MSI, который лучше всего отражает дефицит MMR в лабораториях по всему миру [6].В целях унификации анализа MSI при CRC в 1997 году семинар Национального института рака (NCI) рекомендовал использовать контрольную панель из пяти маркеров MSI, которые состояли из 2 маркеров мононуклеотидных повторов (BAT26 и BAT25) и 3 маркеров динуклеотидных повторов (D2S123, D5S346). и D17S250) [7]. На последующем семинаре NCI группа признала некоторые ограничения исходных маркеров, в первую очередь из-за включения трех динуклеотидных маркеров [8]. Во-первых, было признано, что маркеры динуклеотидных повторов больше подходят для идентификации опухолей MSI-L, тогда как маркеры мононуклеотидных повторов более специфичны и чувствительны для определения CRC MSI (или MSI-H) [9].Во-вторых, из-за полиморфной природы динуклеотидных маркеров для интерпретации результатов MSI требовалось наличие не только опухоли, но и соответствующей нормальной ДНК от каждого человека. Было показано, что панель из пяти маркеров квазимономорфных мононуклеотидных повторов в пентаплексной ПЦР устраняет необходимость в нормальной ДНК от каждого пациента с CRC и может предложить лучшую специфичность и чувствительность, чем маркеры NCI-панели [10].

К сожалению, несмотря на очевидные сильные стороны, подход MSI с пентаплексом получил ограниченное признание для скрининга CRC на основе MSI.Для этого может быть несколько причин, включая отсутствие четкого понимания технических аспектов и независимой валидации этого анализа. Это исследование решает эту проблему, подтверждая точность маркеров пентаплекс-панели в большой серии CRC с высоким и недостаточным MMR путем анализа профилей, усиленных ПЦР, каждого маркера как в опухоли, так и в соответствующей нормальной ДНК. Здесь мы демонстрируем высокочувствительный и специфический анализ ПЦР с пентаплексом, который требует однократной оптимизации диапазона квазимономорфных вариаций (QMVR) для каждого маркера в нормальной ДНК.Мы предоставляем доказательства того, что оптимизированный анализ ПЦР с пентаплексом должен быть предпочтительным методом для оценки MSI в клинических и исследовательских лабораториях, поскольку он быстрый, экономичный, высокочувствительный и специфичный для обнаружения CRC с дефицитом MMR и устраняет необходимость в эталонной нормальной ДНК.

Материалы и методы

Заявление об этике

Все пациенты предоставили письменное информированное согласие, и исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом Медицинского центра Университета Бейлора, Даллас, США; Гейдельбергский университет, Гейдельберг, Германия; и университетская больница Окаяма, Окаяма, Япония.

Образцы тканей

Опухоль и совпадающая ДНК зародышевой линии были собраны у 213 пациентов с диагнозом CRC в трех различных учреждениях: 1) Медицинский центр Университета Бейлора, Даллас, Техас, США 2) Гейдельбергский университет, Гейдельберг, Германия и 3) Университетская больница Окаяма, Окаяма, Япония . Среди этой когорты 114 опухолей были с дефицитом MMR и включали 50 CRC с потерей MLh2, 48 с потерей MSh3 и 8 случаев с исключительной потерей белков PMS2 или MSH6. В остальных 99 случаях вакцина MMR была успешной.

Иммуногистохимия белков MMR

Мы исследовали экспрессию белка MLh2, MSh3, PMS2 и MSH6 в 213 опухолевых тканях с помощью иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания с использованием набора полимерной системы DAKO EnVision System-HRP (Dako Cytomation Inc., Carpinteria, CA). Срезы тканей зондировали соответствующими разведениями мышиных моноклональных антител против MLh2 (клон 13271A, BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния), MSh3 (клон FE11, Oncogen Research Products, Бостон, Массачусетс), PMS2 (клон A37, BD Pharmingen San Diego, CA) и белок MSH6 (клон 44, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY).Опухолевые клетки считались отрицательными на экспрессию белка MMR только в том случае, если эпителиальные клетки в опухолевой ткани не обладали ядерным окрашиванием, в то время как окружающие стромальные клетки все еще показывали положительное окрашивание.

Микродиссекция и амплификация ДНК

Серийные срезы (5 мкм) из фиксированных формалином залитых парафином совпадающих нормальных и опухолевых тканей обычно окрашивали, а репрезентативные нормальные и опухолевые области идентифицировали с помощью микроскопического исследования. Геномную ДНК выделяли из залитых в парафин тканей с использованием мини-набора QIAamp DNA (Qiagen, Валенсия, Калифорния) после отделения опухоли от нормальной ткани с помощью микродиссекции вручную.

Пентаплекс ПЦР и диапазон квазимономорфной вариации (QMVR) Определение

был проведен с использованием пяти микросателлитных мишеней с мононуклеотидными повторами (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 и NR-27) в системе pentaplex PCR [10]. Последовательности праймеров были описаны ранее, и каждый смысловой праймер метили на конце одним из флуоресцентных маркеров: FAM, HEX или NED [11]. ПЦР Pentaplex выполняли в мультициклере MJ Research DNA 200 (Biorad, Hercules, CA). Условия ПЦР включали начальную 15-минутную стадию денатурации при 95 ° C, затем 35 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд, с последующим продлением при 72 ° C. на 10 мин.Амплифицированные продукты ПЦР разбавляли формамидом и запускали на автоматическом секвенаторе ДНК для капиллярного электрофореза Applied Biosystems 3100 Avant. Размеры аллелей для каждого из маркеров оценивали с помощью программного обеспечения GeneMapper 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Для определения и подтверждения диапазона квазимономорфной вариации (QMVR) для каждого из пяти маркеров MSI профили амплификации ПЦР оценивались индивидуально, и размер обоих аллелей определялся для каждого маркера и для каждой опухоли индивидуально, как описано ранее. [11].Для целей расчета из-за мономорфной природы этих маркеров мы дважды рассчитали размер каждого аллеля в гомозиготных выборках.

Определение аллельных вариаций в опухолевой ДНК по сравнению с нормальной ДНК

Затем мы исследовали, повысит ли доступность подходящей нормальной ДНК пациента с CRC эффективность скрининга с помощью ПЦР с пентаплексом в CRC с дефицитом MMR. Мы рассчитали различия в длине аллелей между опухолевой и нормальной ДНК для каждого пациента и каждого маркера MSI.В каждом случае для расчетов мы рассматривали самый короткий аллель, присутствующий в опухоли или нормальной ДНК, используя следующую формулу:

(Разница в длине аллеля) = | (Нормальный аллель ДНК) — (Аллель опухолевой ДНК) | (пп)

Если фрагмент ПЦР ДНК опухоли выявил два пика, мы рассматривали более короткий пик, представляющий ДНК опухоли.

Анализ MSI по маркерам NCI-Panel

Чтобы сравнить чувствительность и специфичность ПЦР с пентаплексом с исходной NCI-панелью маркеров (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 и D17S250), мы провели анализ MSI на подмножестве 86 CRC с дефицитом MMR и 37 CRC с высоким MMR, используя оба подходы [7].Праймеры для каждого из 5 маркеров были описаны ранее [12], [13].

Статистический анализ

Мы использовали логистический регрессионный анализ для изучения диагностической эффективности CRC с недостаточным MMR, используя различные стратегии для определения MSI. Чтобы изучить взаимосвязь между отдельными маркерами MSI, была проведена многомерная корреляция и анализ иерархической кластеризации с использованием стандартизированной абсолютной разницы длины между аллелем опухоли и аллелем зародышевой линии / нормальным.Анализы проводились с использованием JMP (версия 6.0, институт SAS). Все указанные значения P являются двусторонними, и P <0,05 считался статистически значимым.

Результаты

CRC с недостаточным и достаточным MMR

Чтобы определить точность системы pentaplex PCR для выявления CRC с дефицитом MMR, мы исследовали когорту из 213 CRC, которые включали 114 опухолей с дефицитом MMR и 99 опухолей с дефицитом MMR. В Таблице 1 перечислены клинические особенности CRC с недостаточным и эффективным использованием MMR.

Определение и оптимизация QMVR для каждого маркера с помощью нормальной ДНК

Хотя было высказано предположение, что пять моноповторных маркеров в pentaplex PCR являются высоко мономорфными в ДНК зародышевой линии из широкого спектра популяций во всем мире, успех этого анализа MSI в значительной степени зависит от точного определения QMVR для каждого маркера в нормальной ДНК [ 11]. Теоретически QMVR для каждого маркера должен быть постоянным в каждой экспериментальной обстановке, но данные показывают, что конкретное оборудование или реагенты могут частично влиять на измерения размера аллелей для каждого маркера [11].Это требует одноразового тщательного определения QMVR в ДНК зародышевой линии перед анализом MSI опухоли. Мы амплифицировали с помощью ПЦР 426 аллелей из 213 нормальных образцов ДНК, чтобы определить QMVR для каждого маркера MSI. Как показано на рис. 1 , полиморфный диапазон для каждого маркера MSI в нормальной ДНК следующий: NR 27 (82–87 п.н.), NR21 (102–106 п.н.), NR24 (120–125 п.н.), BAT25 (142 п.н.) –148 п.н.) и BAT26 (174–179 п.н.). Наиболее распространенный аллель для каждого из маркеров был следующим: NR27 (85 п.н.), NR21 (105 п.н.), NR24 (123 п.н.), BAT25 (145 п.н.) и BAT26 (178 п.н.).В отличие от предыдущих исследований, в которых использовались здоровые субъекты для генерации QMVR для каждого маркера [11], значения QMVR в нашем исследовании были основаны на большой серии совпадающих нормальных образцов ДНК, полученных от пациентов с CRC. Мы заметили, что наши наиболее распространенные аллели были короче для каждого маркера (BAT26 на 1 п.н., NR21 и NR27 на 2 п.н. и BAT25 и NR24 на 3 п.н.), и поэтому оптимизированный QMVR был немного смещен влево, как показано серыми заштрихованными областями на рис. . После этого мы считали опухоль положительной по аллельной вариации (или нестабильной) по данному маркеру, когда размеры аллелей опухоли не попадали в оптимизированный QMVR.Подтверждая специфичность нашего недавно оптимизированного QMVR, мы отметили, что почти все профили амплификации от всех опухолей с MMR попадали в этот диапазон, в то время как почти все опухоли с дефицитом MMR демонстрировали большие аллельные вариации по нескольким маркерам и находились за пределами этого диапазона (рис. 1Б ).

Рисунок 1. Частота распределения размеров аллелей для пяти маркеров пентаплекса.

A) Распределение размеров аллелей (в парах оснований) из 213 нормальных образцов ДНК. Для каждого маркера синяя заливка указывает скорректированный QMVR, а серая заливка указывает весь диапазон размера аллеля, полученный из 426 аллелей зародышевой линии.Б) Распределение размеров аллелей в CRC с дефицитом MMR (оранжевый) и с профицитом MMR (зеленый).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009393.g001

Определение аллельных вариаций в опухолевой ДНК для каждого маркера и его отношения к статусу MMR в CRC

Мы отметили, что из-за значительной согласованности между результатами MMR IHC и MSI для каждого маркера мы используем информацию IHC для расчета пороговых значений, которые соответствуют потере экспрессии белка MMR ДНК и дефициту MMR.Мы определили пороговые значения для каждого из пяти маркеров, определив вариации длины конкретных аллелей, при которых не менее 95% опухолей находились в пределах QMVR (не демонстрировали нестабильности) и одновременно были эффективны по MMR согласно результатам IHC. Таким образом, мы успешно определили, что аллельное различие> 3 п.н. между опухолью и соответствующей нормальной ДНК как для BAT25, так и для BAT26 было диагностическим для MSI-положительной опухоли. Точно так же разница> 2 п.н. в ДНК опухоли и зародышевой линии для NR21, NR24 и NR27 считалась положительной для определения MSI-положительности (серый квадрат в квадрате на , фиг. S1 ).

Рабочие характеристики

Затем мы исследовали рабочие характеристики отдельных маркеров пентаплекса, особенно относительно малоизученных NR-маркеров для идентификации CRC с дефицитом MMR (, таблица 2, ). Наш анализ с использованием «только значений QMVR» ясно показал надежность различных моно-маркеров для обнаружения CRC с дефицитом MMR с чувствительностью , которая варьировалась от 86.От 8% до 94,7% и специфичность от 96,0% до 100% для определения CRC, владеющих MMR. Интересно, что когда результаты были повторно проанализированы с использованием «данных из соответствующей нормальной ДНК», результаты были поразительно похожими: каждый маркер имел диапазон чувствительности от 85,1% до 95,6% для выявления CRC с дефицитом MMR и специфичность от 95,0% до 100% для выявления CRC-зависимых MMR.

Оптимизированная ПЦР Pentaplex не требует сопоставления нормальной ДНК для обнаружения CRC с дефицитом MMR

Затем мы проанализировали эффективность всех моно-маркеров в пентаплексном ПЦР-анализе как для КПР с дефицитом MMR, так и для эффективных CRC, используя два подхода: во-первых, с использованием «только результатов QMVR» ( Рисунок 2A левые панели и Таблица 3 ), и, во-вторых, когда были доступны данные из «соответствующей нормальной ДНК от пациентов с CRC» (, фиг. 2A, , правые панели и , таблица 4, ).Когда аллельные вариации ≥3 из 5 маркеров были определены как диагноз MSI, обе стратегии показали чувствительность 93,9% (CI, 87,9–97,0%) для идентификации CRC с дефицитом MMR и 100% (CI, 96,3–100%) специфичность для CRC, владеющих MMR. Что касается корреляции данных MSI со статусом экспрессии белка MMR, обе стратегии продемонстрировали аналогичную чувствительность для опухолей с дефицитом MLh2 (96,0%), MSh3 (100%) и PMS2 (100%). Однако ни один из подходов не был достаточно надежным для обнаружения дефицита MSH6 и идентифицировал только 37.5% (3/8) CRC с дефицитом MSH6 (, рис. 2В, ). Напротив, когда MSI-H определялся нестабильностью при ≥2 из 5 маркеров, обе стратегии продемонстрировали немного улучшенную чувствительность для CRC с дефицитом MMR (95,6%; CI, 90,1–98,1%) и ту же специфичность для CRC с дефицитом MMR (100 %; ДИ 96,3–100%). Но это улучшение было связано только с повышенной чувствительностью для выявления опухолей с дефицитом MSH6 (62,5%; 5 из 8 CRC) без какого-либо связанного изменения чувствительности для идентификации MLh2 (96,0%), MSh3 (100%) и PMS2 (100%). %) с дефицитом ( Рисунок 2B ).Следовательно, оптимизированный анализ пентаплекса является высокоспецифичным и чувствительным для обнаружения CRC с дефицитом MMR, и что наличие нормальной ДНК у пациента с CRC не обязательно повышает его эффективность. Кроме того, использование порога нестабильности на уровне ≥2 / 5 маркеров для определения MSI приводит к максимальной чувствительности и специфичности для этого анализа, особенно для образцов, мутантных по MSH6.

Рисунок 2. Рабочие характеристики маркеров пентаплекса на основе QMVR, наличия нормальной ДНК и количества маркеров, необходимых для определения MSI при колоректальном раке.

A ) На рисунке показана эффективность панели производителей мононуклеотидных повторов пентаплекса при определении MSI-статуса опухолевой ДНК с помощью «только QMVR» (когда соответствующая нормальная ДНК не была доступна) и с помощью «нормальной ДНК» путем вычитания длины аллелей зародышевой линии от опухоли для каждой опухоли. Данные на двух панелях слева относятся к опухолям с дефицитом MMR, в то время как на двух других панелях справа представлены CRC с эффективностью MMR. (* указывает один случай с потерей как MLh2, так и MSh3).Черные квадраты указывают на опухоль, положительную по аллельным вариациям (т. Е. Нестабильную), а белые квадраты указывают на отрицательную опухоль по любым аллельным вариациям (т. Е. Стабильные). B ) Показывает частоту опухолей с дефицитом MMR с количеством маркеров, отображающих аллельные вариации, при анализе данных по всем пяти маркерам пентаплекса. C ) Показывает частоту опухолей с дефицитом MMR с количеством маркеров, отображающих аллельные вариации, при анализе данных только для трех маркеров пентаплекса (BAT26, NR21 и NR27).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009393.g002

Ассоциация между маркерами мононуклеотидных повторов пентаплекса

Затем мы спросили, существует ли ассоциация между отдельными маркерами мононуклеотидных повторов или нестабильность каждого маркера является независимым событием. Для этого мы выполнили многомерную корреляцию, а также анализ иерархической кластеризации путем сравнения различий в размерах аллелей, полученных от опухоли и нормальной ДНК (, рисунки 3A и B, ).Все коэффициенты корреляции (r) продемонстрировали значения более 0,75, что свидетельствует о сильной взаимной ассоциации между маркерами. Однако при анализе конкретных парных ассоциаций мы заметили, что BAT26, NR21 и NR27 показали более высокие коэффициенты корреляции между собой (, рис. 3A, ). Эти наблюдения были подтверждены в ходе анализа иерархической кластеризации, в котором мы заметили, что NR24 был дальше всего от вершины иерархического дерева, за ним следует BAT25 по сравнению с микросателлитными повторами BAT26, NR21 и NR27, которые были более тесно коррелированы ( Рисунок 3B ).

Рисунок 3. Корреляция между различными мононуклеотидными маркерами в пентаплексной ПЦР.

A ) Матрица диаграммы разброса, демонстрирующая коэффициент попарной корреляции (r) между пятью микросателлитными маркерами в когорте CRC с эффективностью MMR и недостаточностью CRC. Ось Y и X обозначает абсолютные различия в размерах аллелей между ДНК опухоли и нормальной ДНК. B ) На рисунке показан иерархический кластерный анализ, полученный из 104 CRC с дефицитом MMR и 99 CRC с высоким уровнем MMR.Данные представлены в матричном формате, в котором строки представляют каждый CRC, а столбцы указывают индивидуальные маркеры мононуклеотидов. Цветовая шкала представляет градиент (от зеленого к красному) абсолютных различий в длине аллелей между ДНК опухоли и зародышевой линии из стандартизованных данных QMVR; от зеленого (нет различий в размере аллеля между опухолью и нормальной ДНК) до красного (значительные различия в длине аллеля между опухолью и нормальной ДНК).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009393.g003

Сниженная комбинация маркеров столь же эффективна, как и все пять маркеров в анализе Pentaplex

Мы задались вопросом, может ли уменьшенная панель маркеров быть столь же эффективной, как все пять маркеров в панели пентаплекс. Для этого мы повторно проанализировали эффективность скрининга ПЦР с пентаплексом для выявления CRC с дефицитом MMR на основе всех пяти или выбранной панели из трех маркеров (BAT26, NR21 и NR27) для классификационного анализа MSI (, таблицы 3 и 4 ).

Когда MSI был определен как нестабильность при ≥1 или ≥2 из 3 маркеров, снова были получены сопоставимые степени чувствительности (93,9–97,4%) и специфичности (92,9–100%). Что касается статуса экспрессии белка MMR, обе стратегии показали одинаковую чувствительность для опухолей с дефицитом MLh2 (96,0%), MSh3 (100%) и PMS2 (100%). Однако, как отмечалось ранее для панели из пяти маркеров , порог отсечки нестабильности ≥2 из 3 маркеров привел к повышенной чувствительности для обнаружения CRC с дефицитом MSH6 (62.5%; 5 из 8 опухолей; Рисунок 2C ). Хотя чувствительность анализа MSI с использованием этих критериев незначительно ниже 93,9% (ДИ 87,9–97,0%) по сравнению с использованием всех пяти маркеров 95,6% (ДИ 90,1–98,1%), специфичность этого анализа осталась неизменной (100%). , с обеими панелями маркеров).

Эффективность скрининга анализа Pentaplex лучше, чем с маркерами NCI-Panel

NCI-панель маркеров MSI (2 моно маркера; BAT25 и BAT26 и 3 динуклеотидных маркера; D3S1023, D5S346 и D17S250) в настоящее время является стандартом для определения MSI в CRC [7].Динуклеотидные маркеры в этой панели требуют одновременной амплификации подобранной нормальной ДНК для одного и того же пациента с CRC и лучше подходят для обнаружения опухолей MSI-L, чем опухолей MSI. Поскольку маркеры пентаплекса являются квазимономорфными, мы сравнили эффективность скрининга этих двух анализов MSI для идентификации двух наиболее часто дефектных белков MMR, MLh2 и MSh3 в нашей коллекции CRC. Как показано на фиг. 4A и B , маркеры пентаплекса продемонстрировали лучшую или сопоставимую чувствительность и специфичность с маркерами панели NCI для идентификации CRC с дефицитом MMR.При таком сценарии ПЦР с пентаплексом предлагает огромное общее преимущество перед NCI-маркерами, поскольку он более быстрый, использует одну реакцию ПЦР, устраняет необходимость в нормальной ДНК, дешевле и отличается высокой точностью.

Рисунок 4. Сравнение пентаплекс ПЦР и панели маркеров NCI для определения MMR-дефицита при колоректальном раке.

A ) На рисунке показано сравнение производительности маркеров панели NCI и оптимизированной QMVR pentaplex PCR. Черные квадраты указывают на опухоль, положительную по аллельным вариациям (или нестабильную), а белые квадраты указывают на опухоль, отрицательную по любым аллельным вариациям (или стабильные).Маркеры динуклеотидных повторов (D2S123, D5S346 и D17S250) менее устойчивы, чем мононуклеотидные повторы для обнаружения MSI. B ) На рисунке показана частота опухолей с рядом маркеров, отображающих аллельные вариации в MMR-дефицитных и эффективных CRC. Как указано, pentaplex PCR показывает более высокую чувствительность и специфичность по сравнению с панелью маркеров NCI, и распределение измененных маркеров однозначно бимодальное.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0009393.g004

Обсуждение

Целью этого исследования было разработать быстрый и высокоточный анализ MSI, который можно адаптировать в любой лаборатории, оснащенной автоматическим секвенатором ДНК. Здесь мы оптимизировали и подтвердили полезность пяти мононуклеотидных микросателлитных маркеров, которые могут быть амплифицированы в одной реакции ПЦР с пентаплексом для определения MSI в большой серии CRC с эффективностью и недостаточностью MMR.

MSI с панелью NCI из пяти микросателлитных маркеров (2 моно- и 3 динуклеотидных повтора) по-прежнему остается предпочтительным методом в большинстве клинических и исследовательских лабораторий.К сожалению, хотя многочисленные исследования неоднократно показывали, что мононуклеотидные маркеры MSI предлагают более высокую точность для обнаружения опухолей с дефицитом MSI-H или MMR [10], этот подход не получил достаточного признания или принятия. Одна из ключевых технических проблем этого анализа — необходимость тщательной однократной оптимизации QMVR для каждого моно-маркера. Это связано с тем, что на оценку размера аллелей для этих квазимономорфных маркеров можно повлиять с помощью использования определенных реагентов или секвенатора [14].Поддерживая эту концепцию, QMVR для всех маркеров в нашей популяции пациентов отличается на несколько пар оснований, чем сообщалось ранее [11], [14]. Мы полагаем, что QMVR в нашем исследовании более надежны, поскольку они были получены из соответствующей ДНК нормальной / зародышевой линии от большой серии пациентов с CRC, а не от здоровых людей, как сообщалось ранее [11], [14]. Предыдущие исследования подчеркнули полезность маркеров BAT25 и BAT26 для идентификации MSI-положительных CRC [9], однако понимание чувствительности и положительной прогностической ценности NR-маркеров ограничено.Недавний отчет показал, что скрининг, основанный на оценке только BAT26 и NR24, может быть эффективным для обнаружения CRC с дефицитом MMR [15]. Фактически, BAT26 имел самую высокую чувствительность и положительную прогностическую ценность в нашей когорте CRC с дефицитом MMR. Напротив, анализ парной корреляции и иерархической кластеризации в нашем исследовании ясно показал самые слабые прогностические значения для NR24 (и BAT25) по сравнению с оставшимися тремя маркерами (BAT26, NR21 и NR27). BAT26 представляет собой квазимономорфный маркер, который расположен непосредственно от 3 ’к MSh3 экзон 5 и считается очень чувствительным и специфичным для тестирования MSI.Однако большие делеции в MSh3 , которые включают локус BAT26, не являются редкостью для CRC, и в таких случаях, хотя опухоль является MMR-дефицитной, ПЦР в локусе BAT26 приведет к ложноотрицательной амплификации аллелей дикого типа. из нормальных клеток в опухолевой массе [16]. Эти данные предостерегают от общепринятого мнения о том, что, хотя BAT26 часто используется для определения MSI, использование только BAT26 или в сочетании с менее точным маркером, таким как NR24, может недооценивать MSI и препятствовать обнаружению CRC с потенциальным MMR-дефицитом.Кроме того, наше наблюдение за высокой чувствительностью и положительной прогностической ценностью для уменьшенной панели из трех маркеров (BAT26, NR21 и NR27) по сравнению со всеми пятью производителями имеет экономические последствия для будущих анализов на основе MSI.

Еще одна критическая проблема с использованием анализа пентаплекс — отсутствие согласия по минимальному количеству нестабильных маркеров, необходимых для классификации опухоли как MSI. В этом контексте в исходном отчете предполагалось, что ≥3 / 5 нестабильных маркеров в опухолевой ДНК будут определять MSI-положительный CRC [10], в то время как последующее исследование показало, что нестабильность только при ≥2 / 5 маркерах была достаточной для обнаружения MMR-дефицитного CRC [15].Мы еще раз рассмотрели этот вопрос, проанализировав данные с помощью нескольких подходов, и наши результаты демонстрируют, что чувствительность и специфичность ПЦР с пентаплексом не изменились независимо от того, считали ли мы пороговое значение ≥2 или ≥3 из 5 маркеров для обнаружения MLh2, MSh3. и CRC с дефицитом PMS2. Тем не менее, мы предполагаем, что критерий ≥2 из 5 нестабильных маркеров является более точным, поскольку он повышает эффективность скрининга анализа за счет выявления дополнительных опухолей с дефицитом MSH6 без добавления каких-либо ложноположительных результатов.

Одним из ограничений NCI-панели маркеров является ее неспособность идентифицировать MSH6-дефицитные CRC. Наши данные показывают, что использование моно-маркеров в пентаплексной панели может идентифицировать большинство CRC с дефицитом MSH6. Это важно, потому что комплекс MutSα, гетеродимер MSh3 и MSH6, предпочтительно распознает несовпадения оснований / оснований, а также небольшие петли вставки / делеции, содержащие 1 или 2 неспаренных нуклеотида в последовательности ДНК, и направляет репарацию этих повреждений [17] .Следовательно, можно было ожидать, что функциональная потеря MutSα из-за дефицита MSH6 приведет к преимущественной нестабильности в локусах, содержащих мононуклеотидные повторы [18].

В заключение, мы представляем доказательства в пользу использования оптимизированной системы ПЦР pentaplex для скрининга CRC с дефицитом MMR. Наши данные показывают, что однократно оптимизированный QMVR устраняет необходимость в амплификации согласованной нормальной ДНК для определения нестабильности в опухолевой ткани, и что нестабильность ≥2 из 5 маркеров обеспечивает наиболее надежную стратегию для выявления CRC с дефицитом MMR.Наши данные показывают, что панель маркеров, состоящая из маркеров BAT26, NR21 и NR27, была такой же точной, как панель с пятью маркерами для анализа MSI. Важно отметить, что маркеры пентаплекса показали более высокую чувствительность для диагностики CRC с дефицитом MSH6. Мы предполагаем, что этот анализ заменит существующие методологии и поможет улучшить скрининг CRC на основе MSI в будущем.

Вспомогательная информация

Рисунок S1.

Частота различий в размере аллелей (в п.н.) между нормальной и опухолевой ДНК по каждому маркеру и определение статуса MSI с помощью QMVR (горизонтальные полосы синего и красного цвета слева), а также по статусу экспрессии белка MMR с помощью IHC (горизонтальные полосы зеленого и оранжевого цветов справа).Числа на оси Y представляют разницу в размерах аллелей (в п.н.) между нормальной и опухолевой ДНК. Цифры в красном цвете отражают пороговые значения микросателлитной нестабильности, определенные для каждого из маркеров на основе их отклонения от диапазона QMVR и данных IHC.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009393.s001

(1,59 МБ TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Johannes Gebert, PhD, и Matthias Kloor, MD (Институт патологии, Университет Гейдлеберга, Германия) за щедрое предоставление образцов рака толстой кишки, а также за полезные обсуждения и критический обзор рукописи.

Вклад авторов

Эксперимент задумал и спроектировал: AG TN RH. Проведены эксперименты: А.Г. Т.Н. Проанализированы данные: AG TN RH. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: AG RH. Написал статью: AG CRB.

Ссылки

1. 1. Bronner CE, Baker SM, Morrison PT, Warren G, Smith LG и др. (1994) Мутация в гомологе гена репарации ошибочного спаривания ДНК hMLh2 связана с наследственным неполипозным раком толстой кишки. Природа 368: 258–261.
2. 2. Ионов Ю., Пейнадо М.А., Малхосян С., Шибата Д., Перучо М. (1993) Повсеместные соматические мутации в простых повторяющихся последовательностях раскрывают новый механизм канцерогенеза толстой кишки. Nature 363: 558–561.
3. 3. Thibodeau SN, Bren G, Schaid D (1993) Микросателлитная нестабильность при раке проксимального отдела толстой кишки. Наука 260: 816–819.
4. 4. Кейн М.Ф., Лода М., Гайда Г.М., Липман Дж., Мишра Р. и др. (1997) Метилирование промотора hMLh2 коррелирует с отсутствием экспрессии hMLh2 в спорадических опухолях толстой кишки и линиях опухолевых клеток человека, дефектных по репарации несоответствия.Cancer Res 57: 808–811.
5. 5. Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, Thibodeau SN, French AJ, et al. (2003) Статус микросателлитной нестабильности опухоли как прогностический фактор преимущества адъювантной химиотерапии на основе фторурацила при раке толстой кишки. N Engl J Med 349: 247–257. 10.1056 / NEJMoa022289 [doi]; 349/3/247 [pii].
6. 6. Laghi L, Bianchi P, Malesci A (2008) Различия и эволюция методов оценки микросателлитной нестабильности. Онкоген 27: 6313–6321.
7. 7. Боланд Ч. Р., Тибодо С. Н., Гамильтон С. Р., Сидранский Д., Эшлеман Дж. Р. и др. (1998) Семинар Национального института рака по нестабильности микросателлитов для выявления рака и семейной предрасположенности: разработка международных критериев для определения нестабильности микросателлитов при колоректальном раке. Cancer Res 58: 5248–5257.
8. 8. Umar A, Boland CR, Terdiman JP, Syngal S, de la CA, et al. (2004) Пересмотренное руководство Bethesda по наследственному неполипозному колоректальному раку (синдром Линча) и микросателлитной нестабильности.J Natl Cancer Inst 96: 261–268.
9. 9. Perucho M Correspondence re: C.R. Boland et al., Семинар Национального института рака по микросателлитной нестабильности для выявления рака и семейной предрасположенности: разработка международных критериев для определения микросателлитной нестабильности при колоректальном раке. Cancer Res., 58: 5248–5257, 1998. Cancer Res. 59: 249–256.
10. 10. Suraweera N, Duval A, Reperant M, Vaury C, Furlan D и др. (2002) Оценка микросателлитной нестабильности опухоли с использованием пяти квазимономорфных мононуклеотидных повторов и пентаплексной ПЦР.Гастроэнтерология 123: 1804–1811.
11. 11. Бухард О., Каттанео Ф., Вонг Ю.Ф., Йим С.Ф., Фридман Э. и др. (2006) Многопопуляционный анализ полиморфизмов пяти мононуклеотидных повторов, используемых для определения статуса микросателлитной нестабильности опухолей человека. Дж. Клин Онкол 24: 241–251.
12. 12. Goel A, Arnold CN, Niedzwiecki D, Chang DK, Ricciardiello L, et al. (2003) Характеристика спорадического рака толстой кишки по моделям геномной нестабильности. Cancer Res 63: 1608–1614.
13. 13. Гоэль А., Нагасака Т., Арнольд К.Н., Иноуэ Т., Гамильтон С. и др. (2007) Фенотип метилирования острова CpG и хромосомная нестабильность обратно коррелируют при спорадическом колоректальном раке. Гастроэнтерология 132: 127–138.
14. 14. Buhard O, Suraweera N, Lectard A, Duval A, Hamelin R (2004) Квазимономорфные мононуклеотидные повторы для анализа микросателлитной нестабильности высокого уровня. Dis Markers 20: 251–257.
15. 15. Xicola RM, Llor X, Pons E, Castells A, Alenda C и др.(2007) Эффективность различных панелей микросателлитных маркеров для обнаружения колоректальных опухолей с дефицитом репарации несоответствия. J Natl Cancer Inst 99: 244–252.
16. 16. Пастрелло С., Баглиони С., Тибилетти М.Г., Папи Л., Форнасариг М. и др. (2006) Стабильность BAT26 в опухолях пациентов с наследственным неполипозным колоректальным раком с внутригенной делецией MSh3. Eur J Hum Genet 14: 63–68. 5201517 [pii]; 10.1038 / sj.ejhg.5201517 [doi].
17. 17. Модрич П. (2006) Механизмы репарации несоответствия эукариотами.J Biol Chem 281: 30305–30309.
18. 18. Verma L, Kane MF, Brassett C, Schmeits J, Evans DG и др. (1999) Мононуклеотидная микросателлитная нестабильность и анализ мутации MSH6 зародышевой линии при раннем колоректальном раке. J Med Genet 36: 678–682.

Анализ ПЦР pentaplex для быстрого обнаружения метициллин-устойчивого золотистого стафилококка и лейкоцидина Пантона-Валентайна | BMC Microbiology

Q-See QSD2304L-320 4-канальный сетевой видеорегистратор H.264 Pentaplex с записью в реальном времени, наблюдение с мобильного телефона и предустановленный 320 ГБ HDD

Это началось примерно через месяц после того, как я переехал — сначала кто-то выстрелил в витрину моего магазина из пневматического пистолета, а через несколько дней они бросили в окно два камня в 1:30 утра. Сработала сигнализация, и через 90 секунд прибыли полицейские, но ущерб был нанесен, и я получил колоссальный счет от моей стекольной компании.

Итак, я решил, что в следующий раз, когда это произойдет, я запишу все это на видео, чтобы я мог идентифицировать вандалов и передать информацию полиции.Я купил на Amazon видеорегистратор QSD2340L-320, четыре камеры Q-See и микрофон прямо у входной двери.

Я должен сказать — хотя я довольно техничен, установка прошла легко. Все компоненты Q-SEE поставлялись со всем необходимым, так что буквально нужно было просто подключить все к DVR, и это сработало с первого раза.

По пути я узнал кое-что о видеонаблюдении. Когда я впервые установил камеры, я нацелил их на стеклянные поверхности окон, дверей и т. Д.Затем я понял, что мне нужна была возможность точно идентифицировать лица любых вандалов или грабителей, поэтому я переставил камеры так, чтобы все подходы к моему магазину фиксировались на камерах. Второе, что я обнаружил, это то, что камеры с ИК-подсветкой не любят устанавливать за стеклом — стеклянные окна отражают ИК-излучение обратно на объектив, полностью стирая видео в ночное время. Поэтому я заменил одну из камер на модель без ИК-подсветки. На другой камере открутил лицевую панель и перерезал провод к ИК-осветителю.Задача решена. Оказывается, уличные фонари очень светят, чтобы записывать хорошее видео ночью, так что ИК-подсветка мне вообще не понадобилась.

Наконец, я узнал, что фокусное расстояние объектива имеет решающее значение — поскольку я хотел охватить большую площадь, мне нужны были широкоугольные объективы. Amazon не особенно хорош в перечислении фокусных расстояний объективов камер наблюдения в их описаниях, но когда я зашел на собственный сайт Q-SEE, я смог найти спецификации фокусных расстояний для каждой камеры, которую они предлагают, и я заказал камеры с максимально широкие линзы.По крайней мере, одна из камер Q-See поставляется со стандартным объективом «c-mount», что позволяет при желании установить более широкий объектив более высокого класса.

Что касается видеорегистратора, то я не мог не радоваться. В нем было все необходимое, чтобы запустить его, включая хорошо написанное 70-страничное руководство по эксплуатации. С жестким диском емкостью 320 ГБ вы можете записывать видео с четырех камер в высоком качестве 24 часа в сутки, и вы получите видео за две или три недели, прежде чем система начнет стирать старое видео и заменять его новым.А если есть какие-либо события, которые вы хотите заархивировать, вы можете либо выгрузить их на жесткий диск USB, либо записать на записывающее устройство DVD-R. Отлично.

Мне очень нравятся различные варианты управления видеорегистратором — есть кнопки на передней панели, ИК-пульт и USB-мышь. Я спрятал рекордер в очень удаленном и труднодоступном месте, а затем использовал активные удлинительные кабели USB для подключения мыши к видеорегистратору. Рядом с USB-кабелем я проложил S-видео и аудиокабель, который подключается к монитору Vizio с плоским экраном.В результате, если я когда-либо столкнусь с ограблением, мошенники не смогут найти видеорегистратор, поэтому доказательства их действий будут доступны полиции. Другая веская причина для удаленного монтажа цифрового видеорегистратора — это то, что он немного шумный — намного шумнее, чем, скажем, любой из компьютеров в моей студии.

Видеорегистратор имеет стандартный композитный видеовыход и S-видео выход. Композитный выход показал хорошие характеристики при подключении к высококачественному ЭЛТ-монитору Sony, но на ЖК-мониторе Vizio он выглядел очень размытым и контрастным.Поэтому я заказал кабель S-video длиной 25 футов, который улучшил резкость и контрастность ЖК-дисплея.

Теоретически видеорегистратор поддерживает удаленный доступ через Интернет. Я был близок к тому, чтобы это заработало, но пока без радости. У меня есть некоторый опыт в этих вещах, и я бы оценил пользовательский интерфейс Q-SEE DVR и инструкции в этой области как одни из самых сложных для понимания из всех продуктов, которые я использовал.

К счастью, остальная часть устройства проста в использовании и разобраться.Если у вас есть что-то, что вы хотите защитить, это недорогое и элегантное решение. Я также установил три разных типа камер Q-SEE и их микрофон. Все превзошло мои ожидания по качеству и производительности. Настоятельно рекомендуется.

Плюсы:

1. Простота настройки и эксплуатации для всего, кроме удаленного доступа в Интернет.
2. Высокое качество видеозаписи и аудиозаписи, а также просмотр в реальном времени.
3. Множество вариантов ввода и вывода для камер, микрофонов, триггера системы сигнализации и резервного копирования данных
4.Возможность контролировать 4 камеры одновременно и мгновенно увеличивать любую камеру до полноэкранного режима.

Минусы:

1. Вентилятор DVR очень шумный — это не проблема, если вы устанавливаете систему в безопасном удаленном месте
2. Мне не удалось найти способ включать и выключать звук с помощью USB-мыши — очевидно, для этого необходимо использовать ИК-пульт — проблема, когда видеорегистратор устанавливается вдали от места управления
3. Единственные видеовыходы бывают композитные и S-video — хотелось бы еще и стандартный компьютерный видеовыход.

Amazon.com: ProVisual — DVR-1648-ES Цифровой видеорегистратор PENTAPLEX MPEG4, 16 каналов, 480 кадров / с, аудио в реальном времени + жесткий диск 1 ТБ, система безопасности DVR Автономная: Цифровые видеорегистраторы: Электроника

• Убедитесь, что это подходит введя номер вашей модели.
• 480 кадров / с в реальном времени / запись / воспроизведение в реальном времени
• PENTAPLEX: одновременная трансляция, запись, воспроизведение, резервное копирование, сеть
• Скорость записи CIF (360X240) 30 кадров в секунду / H.D1 (720X240) 15 кадров в секунду / D1 (720X480) 7 кадров в секунду
• Поддержка динамического / статического IP-адреса и поддержка клиента / веб-браузера
• Жесткий диск 1 ТБ, перезапись DVR, видеовыход VGA, ИК-пульт дистанционного управления (ВКЛЮЧЕНО)

Опухоли с потерей экспрессии MSH6 представляют собой MSI-H при скрининге пентаплексом из пяти мононуклеотидных повторов

Таблетка Pentaplex-P, 5×1000 таблеток, 350 рупий / коробка Golden Incorporates

Спецификация продукта

Описание продукта

Мы предоставим продукцию в форме заказа на покупку / заказа.

Заинтересовал этот товар? Получите последнюю цену у продавца

Связаться с продавцом

Изображение продукта

О компании

Год основания 2005

Юридический статус Фирмы Физическое лицо — Собственник

Характер бизнеса Оптовый торговец

Количество сотрудников До 10 человек

Годовой оборот До рупий50 лакх

Участник IndiaMART с июля 2014 г.

GST27ABMPY1745P1ZO