Санпин 980 00: СанПиН 2.1.5.980-00. 2.1.5. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод. Санитарные правила и нормы

Статус: действующий

Дата публикации:

Дата введения: 1 января 2001 г.

Количество страниц: 18

Имя файла: sanpin-2-1-5-980-00-gigienicheskie-trebo.pdf

Размер файла: 2,4 МБ

Решение Верховного Суда РФ от 20.12.2017 N АКПИ17-833 — последняя редакция

ВЕРХОВНЫЙ СУД РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Именем Российской Федерации

РЕШЕНИЕ
от 20 декабря 2017 г. N АКПИ17-833

Верховный Суд Российской Федерации в составе:

судьи Верховного Суда Российской Федерации Романенкова Н.С.,

при секретаре Т.П.,

с участием прокурора Масаловой Л.Ф.,

рассмотрев в открытом судебном заседании дело по административному исковому заявлению С., П., К., Ж. о признании частично недействующими пунктов 3.2.2.2, 3.2.2.4, 3.3.2.1 Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.1110-02 «2.1.4. Питьевая вода и водоснабжение населенных мест. Зоны санитарной охраны источников водоснабжения и водопроводов питьевого назначения», утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 26 февраля 2002 г., пункта 3.5 Санитарно-эпидемиологических правил СП 2.2.1.1312-03 «2.2. Гигиена труда. Проектирование, строительство, реконструкция и эксплуатация предприятий. Гигиенические требования к проектированию вновь строящихся и реконструируемых промышленных предприятий», утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22 апреля 2003 г., пунктов 4.5, 6.1, 6.3 Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.5.980-00 «2.1.5. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод», утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22 июня 2000 г.,

установил:

постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 14 марта 2002 г. N 10 введены в действие с 1 июня 2002 г. санитарные правила и нормативы «Зоны санитарной охраны источников водоснабжения и водопроводов питьевого назначения. СанПиН 2.1.4.1110-02», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 26 февраля 2002 г. (далее — СанПиН 2.1.4.1110-02). Нормативный правовой акт зарегистрирован в Министерстве юстиции Российской Федерации 24 апреля 2002 г., регистрационный номер 3399, опубликован в «Российской газете» 8 мая 2002 г., «Бюллетене нормативных актов федеральных органов исполнительной власти» 13 мая 2002 г., N 19.

Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30 апреля 2003 г. N 88 введены в действие с 25 июня 2003 г. санитарно-эпидемиологические правила «Гигиенические требования к проектированию вновь строящихся и реконструируемых промышленных предприятий. СП 2.2.1.1312-03», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22 апреля 2003 г. (далее — СП 2.2.1.1312-03). Нормативный правовой акт зарегистрирован в Министерстве юстиции Российской Федерации 19 мая 2003 г., регистрационный номер 4567, опубликован в «Российской газете» 20 июня 2003 г.

Санитарные правила и нормы СанПиН 2.1.5.980-00 «2.1.5. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод» (далее — СанПиН 2.1.5.980-00) утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22 июня 2000 г. и введены в действие с 1 января 2001 г. Источник публикации: М., Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000, «Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора», N 2, 2001 (по заключению Минюста России документ в государственной регистрации не нуждается, письмо от 1 ноября 2000 г. N 9295-ЮД).

Граждане С., П., К., Ж. обратились в Верховный Суд Российской Федерации с административным исковым заявлением о признании частично недействующими пунктов 3.2.2.2, 3.2.2.4, 3.3.2.1 СанПиН 2.1.4.1110-02, как содержащих правовые неопределенности, пункта 3.5 СП 2.2.1.1312-03, как допускающего размещение новых производственных объектов в зонах санитарной охраны источников водоснабжения с учетом иных санитарных правил и как не подлежащего применению при проектировании и государственной экспертизе проектной документации новых производственных объектов, размещенных в зонах санитарной охраны источников водоснабжения, если площадка для строительства была выбрана на предпроектной стадии, пунктов 4.5, 6.1, 6.3 СанПиН 2.1.5.980-00, как не подлежащих применению в отношении объектов капитального строительства, не использующих водный объект в конкретно указанных целях, а пункт 6.1 также, как содержащий неопределенность в вопросе о том, какие объекты способны оказать влияние на качество водных объектов, ссылаясь на то, что оспариваемые положения нормативных правовых актов не соответствуют пункту 4 статьи 1, части 5 статьи 49 Градостроительного кодекса Российской Федерации, статье 37, части 2 статьи 43 Водного кодекса Российской Федерации, статьям 12, 18, 19 Федерального закона от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» и нарушают их права на благоприятную окружающую среду.

Как указывают административные истцы, государственное автономное учреждение «Управление государственной экспертизы Республики Башкортостан» выдало положительные заключения государственной экспертизы проектной документации с результатами инженерных изысканий: «Производство древесностружечных плит деревообрабатывающего комплекса ООО «Кроношпан Башкортостан» от 15 апреля 2014 г. N 02-1-4-016614; «Производство древесностружечных плит деревообрабатывающего комплекса ООО «Кроношпан Башкортостан». Корректировка» от 9 июня 2015 г. N Э481/14-1; «Индустриальный парк в муниципальном районе Уфимский район Республики Башкортостан: Очистные сооружения дождевых стоков (1 этап строительства)» от 15 февраля 2016 г. N 02-1-1-3-0044-16. Эти заключения оспорены гражданами, имеются вступившие в законную силу решения судов. Предметом спора является строительство завода ООО «Кроношпан Башкортостан» в зоне санитарной охраны источников питьевого водоснабжения г. Уфы. По мнению административных истцов, решения судов основаны на несовпадающих толкованиях нормативных правовых актов, регулирующих спорные правоотношения. Государственное автономное учреждение «Управление государственной экспертизы Республики Башкортостан» продолжает выдавать положительные заключения государственной экспертизы на новые очереди завода: «Производство ориентированно-стружечных плит (ОСБ) — 2 этап строительства деревообрабатывающего комплекса ООО «Кроношпан Башкортостан» N 02-1-1-3-0032-16 от 29 января 2016 г.; «После отрицательного заключения Производство древесноволокнистых плит» (МДФ) — 3 этап строительства деревообрабатывающего комплекса ООО «Кроношпан Башкортостан» N 02-1-1-3-0339-16 от 19 декабря 2016 г. При этом строительство завода вызывает массовое недовольство населения.

После вступления решения Ленинского районного суда г. Уфы в законную силу ООО «Кроношпан Башкортостан» разместило АЗС на территории своего завода — в зоне санитарной охраны водозаборов г. Уфы.

Зона санитарной охраны, в пределах которой размещены объекты Индустриального парка, является общей для нескольких источников водоснабжения, среди которых шесть подземных инфильтрационных водозаборов (Южный, Северный, Изякский, Демский, Шакшинский, Кооперативная поляна) и один поверхностный речной водозабор (Северный ковшовой).

В суде представители административных истцов Г., Р. поддержали заявленные требования.

Представитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека М.О., возражала против удовлетворения заявленных требований и пояснила суду, что оспариваемые положения нормативных правовых актов соответствуют действующему законодательству и не нарушают прав административных истцов.

Представитель Министерства юстиции Российской Федерации М.Р. поддержал требования административных истцов в части признания частично недействующими пунктов 3.2.2.4, 3.3.2.1 СанПиН 2.1.4.1110-02 и пояснил, что СанПиН 2.1.5.980-00 нуждается в переработке и представлению на государственную регистрацию в Минюст России.

Выслушав объяснения представителей административных истцов Г., Р., Роспотребнадзора М.О., Минюста России М.Р., пояснения специалиста Т.А., исследовав материалы дела, заслушав заключение прокурора Генеральной прокуратуры Российской Федерации Масаловой Л.Ф., полагавшей, что административный иск не подлежит удовлетворению, и судебные прения, Верховный Суд Российской Федерации не находит оснований для удовлетворения заявленных требований.

Согласно части 2 статьи 43 Водного кодекса Российской Федерации для водных объектов, используемых для целей питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения, устанавливаются зоны санитарной охраны в соответствии с законодательством о санитарно-эпидемиологическом благополучии населения. В зонах санитарной охраны источников питьевого водоснабжения осуществление деятельности и отведение территории для жилищного строительства, строительства промышленных объектов и объектов сельскохозяйственного назначения запрещаются или ограничиваются в случаях и в порядке, которые установлены санитарными правилами и нормами в соответствии с законодательством о санитарно-эпидемиологическом благополучии населения.

В соответствии с Федеральным законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» на территории Российской Федерации действуют федеральные санитарные правила, утвержденные федеральным органом исполнительной власти, осуществляющим федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор, в порядке, установленном Правительством Российской Федерации (пункт 1 статьи 39).

Такими нормативными правовыми актами, устанавливающими запреты и ограничения, являются оспариваемые положения СанПиН 2.1.4.1110-02, СП 2.2.2.1312-03, СанПиН 2.1.5.980-00, изданные уполномоченным федеральным органом исполнительной власти (Положение о федеральном государственном санитарно-эпидемиологическом надзоре, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 5 июня 2013 г. N 476 «О вопросах государственного контроля (надзора) и признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации»).

СанПиН 2.1.4.1110-02 определяют санитарно-эпидемиологические требования к организации и эксплуатации зон санитарной охраны источников водоснабжения и водопроводов питьевого назначения. Зоны санитарной охраны организуются в составе трех поясов: первый пояс (строгого режима) включает территорию расположения водозаборов, площадок всех водопроводных сооружений и водопроводящего канала. Его назначение — защита места водозабора и водозаборных сооружений от случайного или умышленного загрязнения и повреждения. Второй и третий пояса (пояса ограничений) включают территорию, предназначенную для предупреждения загрязнения воды источников водоснабжения.

Мероприятия предусматриваются для каждого пояса зоны санитарной охраны в соответствии с его назначением.

Абзацем первым пункта 3.2.2.4 СанПиН 2.1.4.1110-02 запрещено размещение складов горюче-смазочных материалов, ядохимикатов и минеральных удобрений, накопителей промстоков, шламохранилищ и других объектов, обусловливающих опасность химического загрязнения подземных вод.

Данный пункт СанПиН 2.1.4.1110-02 оспаривается в связи с неопределенностью в вопросе о том, какие объекты обусловливают опасность химического загрязнения подземных вод. Административные истцы полагают, что приведенная норма в оспариваемой части не исключает произвольное толкование перечней объектов, запрещенных к размещению в зонах санитарной охраны.

Целью мероприятий, предусмотренных абзацем первым пункта 3.2.2.4 СанПиН 2.1.4.1110-02, является сохранение постоянства природного состава воды в водозаборе путем устранения и предупреждения возможности ее загрязнения.

В соответствии с ГОСТ 30772-2001 «Межгосударственный стандарт. Ресурсосбережение. Обращение с отходами. Термины и определения», введенным в действие постановлением Госстандарта России от 28 декабря 2001 г. N 607-ст, химическое загрязнение определяется как загрязнение окружающей среды, формирующееся в результате изменения ее естественных химических свойств или при поступлении в среду химических веществ, несвойственных ей, а также в концентрациях, превышающих фоновые (естественные) среднемноголетние колебания количеств каких-либо веществ для рассматриваемого периода времени (пункт 6.15).

Это могут быть химические элементы и соединения (в особенности тяжелые металлы), нефть и нефтепродукты, пестициды, минеральные и органические удобрения, бытовые отходы и различные виды мусора, выхлопы автомобильной и другой техники, радиоактивные вещества, сточные воды и биологические элементы, выбрасываемые в окружающую среду животноводческой отраслью и пр.

Под «другими объектами, обусловливающими опасность химического загрязнения подземных вод», подразумеваются объекты, которые оказывают или могут оказать влияние на качество питьевой воды источника питьевого водоснабжения. Перечень таких объектов не может быть закрытым, поскольку в каждом конкретном случае отнесение объекта к обусловливающим опасность химического загрязнения подземных вод зависит от его влияния на качество питьевой воды источника питьевого водоснабжения.

Статьей 18 Федерального закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» установлены санитарно-эпидемиологические требования к водным объектам. Водные объекты, используемые в целях питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения, а также в лечебных, оздоровительных и рекреационных целях, в том числе водные объекты, расположенные в границах городских и сельских населенных пунктов, не должны являться источниками биологических, химических и физических факторов вредного воздействия на человека. Согласно пункту 3 данной статьи использование водного объекта в конкретно указанных целях допускается при наличии санитарно-эпидемиологического заключения о соответствии водного объекта санитарным правилам и условиям безопасного для здоровья населения использования водного объекта.

В соответствии с абзацем вторым пункта 3.2.2.4 СанПиН 2.1.4.1110-02 размещение объектов, обусловливающих опасность химического загрязнения подземных вод, допускается в пределах третьего пояса зоны санитарной охраны только при использовании защищенных подземных вод, при условии выполнения специальных мероприятий по защите водоносного горизонта от загрязнения при наличии санитарно-эпидемиологического заключения центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора, выданного с учетом заключения органов геологического контроля.

Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» определяет санитарно-эпидемиологическое заключение как документ, выдаваемый в установленных международными договорами Российской Федерации, международными правовыми актами, названным Федеральным законом, другими федеральными законами случаях федеральными органами исполнительной власти, уполномоченными на осуществление федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора, и удостоверяющий соответствие или несоответствие санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям факторов среды обитания, условий деятельности юридических лиц, граждан, в том числе индивидуальных предпринимателей, а также используемых ими территорий, зданий, строений, сооружений, помещений, оборудования, транспортных средств (статья 1).

Предоставление государственных и муниципальных услуг осуществляется в соответствии с административными регламентами (статья 12 Федерального закона от 27 июля 2010 г. N 210-ФЗ «Об организации предоставления государственных и муниципальных услуг»).

Пункт 3.3.2.1 СанПиН 2.1.4.1110-02 оспаривается, как содержащий неопределенность в вопросе о том, какие объекты являются загрязняющими.

Указанный пункт СанПиН 2.1.4.1110-02 находится в разделе 3.3 «Мероприятия на территории ЗСО поверхностных источников водоснабжения». Целью мероприятий является максимальное снижение микробного и химического загрязнения воды источников водоснабжения, позволяющее при современной технологии обработки обеспечивать получение воды питьевого качества.

Согласно пункту 3.3.2.1 СанПиН 2.1.4.1110-02 к мероприятиям по второму и третьему поясам зоны санитарной охраны относятся выявление объектов, загрязняющих источники водоснабжения, с разработкой конкретных водоохранных мероприятий, обеспеченных источниками финансирования, подрядными организациями и согласованных с центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора.

По смыслу приведенных норм в их взаимосвязи к объектам, загрязняющим источники водоснабжения, относятся объекты, загрязняющие источники водоснабжения до микробного и химического состава воды ниже питьевого качества.

В силу пункта 2 статьи 18 Федерального закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» критерии безопасности и (или) безвредности для человека водных объектов, в том числе предельно допустимые концентрации в воде химических, биологических веществ, микроорганизмов, уровень радиационного фона устанавливаются санитарными правилами. Оспариваемый пункт СанПиН 2.1.4.1110-02 непосредственно этот вопрос не регламентирует.

В соответствии с пунктом 3.2.2.2 СанПиН 2.1.4.1110-02 бурение новых скважин и новое строительство, связанное с нарушением почвенного покрова, производится при обязательном согласовании с центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора.

Данный пункт и пункт 3.3.2.1 СанПиН 2.1.4.1110-02 оспариваются, как содержащие неопределенность в вопросе о том, каким документом подтверждается согласование с центром санитарно-эпидемиологического надзора мероприятий по второму и третьему поясам зоны санитарной охраны и является ли обязательным наличие этого документа в составе проектной документации нового строительного объекта. Между тем названные пункты СанПиН 2.1.4.1110-02 имеют иной предмет правового регулирования и состав документов проектной документации не устанавливают.

СП 2.2.1.1312-03 определяют обязательные гигиенические требования к проектированию, строительству, реконструкции и техническому перевооружению производственных объектов, обеспечивающие условия труда, необходимые для сохранения здоровья работающих, и охрану окружающей природной среды от воздействия техногенных факторов, и распространяются на все виды производственных объектов, вне зависимости от ведомственной принадлежности и форм собственности.

Статья 44 Водного кодекса Российской Федерации запрещает сброс сточных, в том числе дренажных, вод в водные объекты, расположенные в границах зон санитарной охраны источников питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения.

Согласно пункту 3.5 СП 2.2.1.1312-03 не допускается размещать новые производственные объекты на рекреационных территориях (водных, лесных, ландшафтных), в зонах санитарной охраны источников водоснабжения, водоохранных и прибрежных зонах рек, морей, охранных зонах курортов.

Пункт 3.5 СП 2.2.1.1312-03 оспаривается, как допускающий размещение новых производственных объектов в зонах санитарной охраны, если площадка для строительства выбрана на предпроектной стадии, что не соответствует содержанию оспариваемой нормы.

Пункт 4 статьи 18 Федерального закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» предусматривает, что для охраны водных объектов, предотвращения их загрязнения и засорения устанавливаются в соответствии с законодательством Российской Федерации согласованные с органами, осуществляющими федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор, нормативы предельно допустимых вредных воздействий на водные объекты, нормативы предельно допустимых сбросов химических, биологических веществ и микроорганизмов в водные объекты.

СанПиН 2.1.5.980-00 устанавливают гигиенические требования к качеству воды водных объектов в пунктах питьевого, хозяйственно-бытового и рекреационного водопользования, к условиям отведения сточных вод в водные объекты.

Проведение строительных, дноуглубительных и взрывных работ, добыча полезных ископаемых, прокладка коммуникаций, гидротехническое строительство и любые другие работы, включая реабилитационные, на водоемах и в зонах санитарной охраны согласно пункту 4.5 СанПиН 2.1.5.980-00 допускаются только при положительном заключении органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы. Данные требования санитарных правил соответствуют пункту 3 статьи 18 Федерального закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

В силу пункта 6.1 СанПиН 2.1.5.980-00 соблюдение данных санитарных правил обязательно при размещении, проектировании, вводе в эксплуатацию и эксплуатации хозяйственных или других объектов и проведении любых работ, способных оказать влияние на качество воды водных объектов. Содержание данной нормы санитарных правил является определенным и не содержит каких-либо неясностей.

Строительство хозяйственных, промышленных и других объектов, в т.ч. очистных сооружений согласно пункту 6.3 СанПиН 2.1.5.980-00 допускается по проектам, имеющим заключение органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы об их соответствии данным санитарным нормам и правилам, что корреспондирует требованиям законодательства в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения (пункту 3 статьи 18 Федерального закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»).

Оспариваемые положения нормативных правовых актов направлены на охрану источников водоснабжения, поскольку согласно пункту 1 статьи 19 Федерального закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» питьевая вода должна быть безопасной в эпидемиологическом и радиационном отношении, безвредной по химическому составу и должна иметь благоприятные органолептические свойства, и не могут рассматриваться как нарушающие права административных истцов на благоприятную окружающую среду.

Доводы административных истцов о противоречии оспариваемых положений санитарных правил нормам Градостроительного кодекса Российской Федерации являются несостоятельными.

Градостроительный кодекс Российской Федерации, раскрывая содержание основных понятий, используемых в данном Кодексе, к зонам с особыми условиями использования территорий, в частности, относит — охранные, санитарно-защитные зоны (пункт 4 статьи 1). Предметом экспертизы проектной документации в соответствии с частью 5 статьи 49 Градостроительного кодекса Российской Федерации является оценка соответствия проектной документации требованиям технических регламентов, в том числе санитарно-эпидемиологическим, экологическим требованиям. Соответственно, перечень мероприятий на территории зон санитарной охраны источников водоснабжения, соблюдение требований санитарных правил проверяются при проведении экспертизы проектной документации.

В силу пункта 2 части 2 статьи 215 КАС РФ по результатам рассмотрения административного дела об оспаривании нормативного правового акта судом принимается решение об отказе в удовлетворении заявленных требований, если оспариваемый полностью или в части нормативный правовой акт признается соответствующим иному нормативному правовому акту, имеющему большую юридическую силу.

На основании изложенного и руководствуясь статьями 175, 176, 180, 215 КАС РФ, Верховный Суд Российской Федерации

решил:

в удовлетворении административного искового заявления С., П., К., Ж. о признании частично недействующими пунктов 3.2.2.2, 3.2.2.4, 3.3.2.1 Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.1110-02 «2.1.4. Питьевая вода и водоснабжение населенных мест. Зоны санитарной охраны источников водоснабжения и водопроводов питьевого назначения», утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 26 февраля 2002 г., пункта 3.5 Санитарно-эпидемиологических правил СП 2.2.1.1312-03 «2.2. Гигиена труда. Проектирование, строительство, реконструкция и эксплуатация предприятий. Гигиенические требования к проектированию вновь строящихся и реконструируемых промышленных предприятий», утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22 апреля 2003 г., пунктов 4.5, 6.1, 6.3 Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.5.980-00 «2.1.5. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод», утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22 июня 2000 г., отказать.

Решение может быть обжаловано в Апелляционную коллегию Верховного Суда Российской Федерации в течение одного месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме.

Судья Верховного Суда
Российской Федерации
Н.С.РОМАНЕНКОВ

СанПиН 2.1.5.980-00 — Всё о переработке и утилизации отходов

СанПиН

Документ содержит санитарные нормы для организаций, отвечающих за добычу, обработку и перевозку стройматериалов. Требования

СанПиН

Документ содержит санитарные нормы для организаций, отвечающих за проектирование и использование самолетов для гражданских

СанПиН

Документ содержит санитарные нормы для издательств, публикующих учебную литературу для начального и среднего образования.

СанПиН

Документ содержит санитарные требования для медицинских учреждений с лабораториями радиоизотопной диагностики. Указанные требования включают

СанПиН

Документ содержит санитарные требования, направленные на осуществление контроля токсичных выбросов в атмосферу и поддержание

СанПиН

Документ содержит санитарные требования для кабинетов рентгенологии в лечебных учреждениях, для снижения риска облучения

Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод. Санитарные правила и нормы

Номер документа

Санитарно-эпидемиологические правила и нормы от 22 Июня 2000 года СанПиН 2.1.5.980-00

Вид документа

Санитарно-эпидемиологические правила и нормы → Санитарно-эпидемиологические правила и нормы

Кто принял постановление

Главный государственный санитарный врач РФ

Разработчики документа

НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды; Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова; Федеральный центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Минздрава России

Область применения (прежде всего для ГОСТ и ФЗ)

Санитарные правила и нормы СанПиН 2.1.5.980-00 устанавливают гигиенические требования к охране поверхностных вод. Требования настоящих санитарных правил распространяются на все поверхностные водные объекты на территории Российской Федерации, используемые или намечаемые к использованию для нужд населения, за исключением прибрежных вод морей. Соблюдение настоящих санитарных правил обязательно при размещении, проектировании, вводе в эксплуатацию и эксплуатации хозяйственных или других объектов и проведении любых работ, способных оказать влияние на качество воды водных объектов.

Термины и определения

-Водоотведение — прием, транспортировка и очистка сточных вод с использованием централизованной системы водоотведения;
-Поверхностные водные объекты — постоянное или временное сосредоточение вод на поверхности суши в формах ее рельефа, имеющее границы, объем и черты водного режима;
-Охрана водных объектов — система мероприятий, направленных на сохранение и восстановление водных объектов

Источник публикации

М., Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава РФ, 2000, «Бюллетень нормативных и методических документов госсанэпиднадзора», N 2, 2001

Ключевые слова

водоотведение; санитарная охрана водных объектов; охрана поверхностных вод

Разработан

НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды; Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова; Федеральный центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Минздрава России

Сведения о качестве питьевой воды на территории ЗАТО Знаменск

Контроль и качество питьевой воды на территории ЗАТО Знаменск.

 Водный объект, который служит основным источником потребления воды- рукав р. Ахтуба, который располагается по следующим координатам: СШ 48⁰ 33 мин. 17,29 сек., ВД 45⁰ 43 мин. 26,82 сек.

Бассейновый округ – Нижневолжский округ.

Водохозяйственный участок – 11.01.00.024 Волга от в/п Светлый Яр до в/п Верхнее Лебяжье.

Расстояние источника водоснабжения от устья – 445 км.

Документ, в соответствии с которым установлено право на забор (изъятие) водных ресурсов – Договор водопользования № 30-11.01.00.024-Р-ДХИО-С-2017-02518/00 от 01.03.2017 года.

Подъем воды осуществляется плавучими насосными станциями ПНС № 2 и ПНС № 3 в целях питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения.

Марка прибора  водоучета – счетчик-расходомер электромагнитый РМ-5 в количестве 2 шт.

Объем допустимого забора воды из водного объекта – 4602,68 тыс. м³.

Фактический объем забранной воды в 2020 году  —  2808,76 тыс. м³.

Наблюдения за водными объектами (их морфометрическими особенностями) проводятся в соответствии с договором №6 от 08.02.2021 года ООО «Эколидер», сведения предоставляются МП «Теплосети» в Отдел водных ресурсов Нижне-Волжского БВУ по Астраханской области и Службу природопользования и охраны окружающей среды – ежеквартально.

Максимальная глубина водотока: 8,05 м

Минимальная глубина водотока: 5,76 м

Средняя глубина водотока: 6,91 м

Уровень над «0» графика водотока: — 23,29 м

Скорость течения: 1,49 м/с

Расход воды в водотоке 2623,6 м³/сек

На предприятии МП «Теплосети» разработаны водохозяйственные мероприятия, мероприятия по охране водного объекта и сохранению водных биологических ресурсов и среды их обитания на 2021 год, утверждены в Службе природопользования и охраны окружающей среды Астраханской области выполняются в установленные сроки. Качество питьевой воды в распределительной сети ЗАТО Знаменск контролируется в соответствии с утвержденной и согласованной в Управлении Роспотребнадзора в Ахтубинском, Харабалинском районах в ЗАТО Знаменск программой производственного контроля.

На предприятии МП «Теплосети» заключен договор на оказание услуг по проведению лабораторных исследований воды с ООО «Группа компаний «Дом науки и техники» № 2020.562312 от 09.01.2021 года.

Согласно программе производственного контроля на исследование сдается вода поверхностного источника в месте водозабора – ежемесячно, питьевая вода перед поступлением в распределительную сеть – ежемесячно, питьевая вода в распределительной сети (по 30 точкам города) – ежемесячно.

Исследования проводят на соответствие нормам:

Поверхностный источник – СанПиН  2.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод», ГН 2.1.5.1315-03, ГН 2.1.5.2280-07, питьевая вода перед поступлением  в распределительную сеть и в распределительной сети (по 30 точкам) —  СанПиН  2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

Превышений показателей проведенных исследований на 15.03.2021 не выявлено, качество воды питьевого водоснабжения соответствует нормам СанПиН

Характеристика вод Усть-Илимского водохранилища и залива реки Вихорева по микробиологическим показателям

С начала марта действуют новые санитарные правила и нормы 2.1.3684-21

Новый СанПиН вступил в силу с 1 марта 2021 года. В нем устанавливаются новые требования к местам накопления твердых коммунальных отходов, частоте влажной уборки мест общего пользования в МКД и контролю качества и безопасности воды.

СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий» был утвержден Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 28 января 2021 года.

В документе много требований, о которых необходимо знать каждому, чтобы не получить штраф. Так, в соответствии с 3 пунктом документа, на территориях городских и сельских поселений в соответствии с территориальной схемой обращения с отходами должны быть обустроены контейнерные площадки для накопления твердых коммунальных отходов или системы подземного накопления ТКО с автоматическими подъемниками. Расстояние от таких площадок до многоквартирных домов должно быть не менее 20 м и не более 100, до территорий медицинских организаций в городских населенных пунктах – не менее 25 м, в сельских населенных пунктах – не менее 15 м (такое расстояние может быть уменьшено максимум на 25 % на основании результатов оценки заявки на создание места накопления ТКО на предмет ее соответствия требованиям СанПиН). На контейнерных площадках может быть не более 8-ми контейнеров для смешанного накопления ТКО или 12 контейнеров, из которых 4 – для раздельного накопления ТКО, и не более 2-х бункеров для накопления крупногабаритных отходов.

При этом срок временного накопления несортированных ТКО определяется исходя из среднесуточной температуры наружного воздуха в течение 3-х суток: если температура выше 5 градусов, то не более 1 суток, а если ниже, то не более 3-х. Вывоз мусора должен осуществляться с промежуток с 7-ми до 23-х часов, а мыть мусоровозы полагается не реже, чем раз в 10 дней.

Теперь все собранные листья деревьев и кустарников на территории населенных пунктов запрещено сжигать категорически, они подлежат вывозу на объекты размещения, обезвреживания или утилизации отходов.

В парках должны быть установлены общественные туалеты исходя из нормы: одна кабинка на 500 посетителей. Также на территории парков должны осуществляться дератизационные и дезинсекционные мероприятия в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями по профилактике инфекционных и паразитарных болезней.

Хозяйствующие субъекты, осуществляющие эксплуатацию системы водоснабжения и (или) обеспечивающие население питьевой и горячей водой, должны информировать территориальный орган федерального органа исполнительной власти, осуществляющего федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор, в течение 2-х часов по телефону и в течение 12-ти часов в письменной форме с момента возникновения аварийной ситуации, технических нарушений, получения результата лабораторного исследования проб воды.

В новых правилах появилось и несколько резонансных пунктов, которые касаются лиц, управляющих многоквартирными домами. Так, пункт 126 документа содержит требование, чтобы в помещениях общего пользования МКД хозяйствующим субъектом, осуществляющим управление многоквартирным домом (управляющей компанией, ТСЖ), должна проводиться ежедневная влажная уборка с применением моющих и чистящих средств. Возможно, это найдет отражение в квитанциях, и плата за услуги УК вырастет в разы. В этом же пункте говорится, что не должно быть синантропных насекомых и грызунов. А в случае их появления хозяйствующие субъекты должны проводить дезинсекционные и дератизационные мероприятия в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями.

Мусоропроводы должны иметь плотный притвор, снабженный резиновыми прокладками, а очистка, помывка и дезинфекция их стволов должна осуществляться не реже раза в месяц.

В помещениях общего имущества многоквартирного дома запрещается хранение и использование опасных химических веществ, загрязняющих воздух. Нельзя захламлять, загрязнять и затоплять подвалы, технические подполия, лестничные пролеты и клетки, а также чердачные помещения.

Теперь на территориях земельных участков многоквартирных домов запрещено мыть транспортные средства, сливать топливо и масло, регулировать звуковые сигналы, тормоза и двигатели.

Загрузку товаров в магазины, встроенные в дома, запрещено выполнять со стороны дворов многоквартирных домов, где расположены входы в жилые помещения.

В 124 пункте указано, что земельные участки многоквартирных жилых домов должны соответствовать гигиеническим нормативам, установленным для атмосферного воздуха, почвы, уровням ионизирующих и неионизирующих излучений территорий населенных мест. Также они должны быть благоустроены, озеленены, оборудованы проездами и тротуарами с твердым покрытием, иметь электрическое освещение, ежедневно убираться, поливаться водой при температуре воздуха выше плюс 10° С, подвергаться антигололедным мероприятиям при температуре ниже 0° С.

Это далеко не все изменения, которыми охарактеризован данный СанПиН, однако они несут риски увеличения плат за услуги УК, которым, в свою очередь, теперь предстоит заняться воплощением этих требований в жизнь.

.

Новости по теме

Войдите , чтобы оставлять комментарии

(PDF) Органическое вещество в воде озер Приамурья

568

ВОДНЫЕ РЕСУРСЫ Vol. 34 № 5 2007

ЛЕВШИНА и др.

(56–60 град), повышенный PO и COD несколько ниже

, чем 1 MAC для рыбы. Характеристики содержания ОВ для рукава

Пальвинская (ст. 20) были несколько выше

, чем для рукава, где расположены станции 18 и 19

(КИ был на 30% выше, а ХПК до

). 1 ПДК рыба).Такими низкими характеристиками были

, что не характерно для озер Орловское и Чля, где из-за низкой температуры

и низкой фотосинтетической активности в них

. Доля ГФА в воде рук

составляла 38–43% С орг.

В отличие от выявленных различий между характеристиками ОМ

в озерах, такие различия между отбором проб

участков в главном Амурском русле были несущественными. Слабое снижение ОВ

зафиксировано из Сикачи —

Алян Вил.(ст. 3) до с. Славянка д. (станция 5) по

с небольшим увеличением вниз по течению

в сторону пос. Нижняя Гавань. (станция 17). В целом,

значения CI и PO воды Амура были незначительно

увеличились и увеличились, а значения COD составили

средних (минимальные значения зафиксированы в селах Славы-

анка и Малмыж (11,4–16,8)). мг / O / лм3), на долю

ГФА приходилось 40–50% С орг, а характеристики ЖК

превышали ГА в 9–12 раз.

В исходной точке отбора проб (участок притока р. Тун-

гуска в Амур, ст. 1) зафиксировано незначительное

повышенных показателей ХИ и ПО. Значение ХПК

было меньше 0,5 АК рыбы, а доля ГФА

была незначительной (26% Сорг). Минимальные

характеристик содержания ОВ зафиксированы в воде

горной реки Саласу (ст. 11), где

значения С орг не превышали 1.5 мг C / дм3, количество HFA

составляет 25% от Cорг. В период исследований

-е гг. РН воды составлял 6.5–7.4, что характерно для забойной воды приповерхностного

в этом районе в период спада весеннего половодья –

летнего паводка [4].

Наибольшее значение для водных экосистем имеет

растворенный O2. Кислородный режим водотоков

, как известно, отражает два противоположных процесса: потребление кислорода

на минерализацию ОВ и его восполнение —

за счет атмосферной аэрации и образование

О2 в процессе фотосинтеза.ПДК растворенного O2

в период открытой воды, установленный для водных объектов

, используемых для рыболовства, составляет не менее 6,0 мг O / дм3

[16]. В период исследований концентрация растворенного O2

в р. Амур и рукава варьировалась в интервале

6,6–8,6 мг O2 / дм3. Более высокая концентрация

(9,2 мг O2 / дм3) и высокий процент водонасыщенности

кислородом (110%) были зафиксированы в озере Петропав-

лосское летом 2004 г. (т воды было около

30 .1 ° C) и объяснялись интенсивной фотосинтетической активностью фитопланктона. Значение доли

водонасыщенности кислородом как в Амуре, так и

в озерных рукавах, равное 90–100%, предполагает преобладание производственных процессов над разрушением, особенно в озерах

.

Значения БПК5 на всей обследованной территории

Амура от реки Тунгуска до озера Болонь, в

в подавляющем большинстве случаев не превышали

2 мг O2 / дм3, что характерно для достаточно ясных вода

тел.Средние значения БПК5 (2,2 мг O2 / дм3) в реках России летом составляют

[8]. Более высокие значения —

у.е. для Амура зафиксированы только в озерах Петропав-

ловское и Падал (5,7 и 4,2 мг O2 / дм3 соответственно

). Это свидетельствует о сильном загрязнении озерных вод

легко окисляемого ОВ. Незначительное увеличение БПК5

было зарегистрировано в озере Калтахевен (2,7 мг O2 / дм3). Процесс оруденения

легкоокисляемого ОВ в

главном русле Амура от Сикачи-Алянского выл.

в Малмыж с. и далее до Нижней Гавани с.

вызвало снижение БПК5 с 1,6 до 1,1 мг O2 / дм3.

Отношения PO / COD часто используются для оценки

природы OM [17]. Высокие значения этого отношения предполагают поступление в воду окрашенных веществ гумусовой природы

, тогда как низкие значения предполагают поступление

ОМ с низким показателем цветности. Происхождение последнего sub-

позиция может быть разной, т.е.г., поступление с атмосферными, подземными

, сточными водами и

новых синтезированных автохтонных веществ. Значения отношения PO / COD

летом имеют более высокие значения (> 0,4) почти для всей воды реки

на исследуемой территории, и особенно высоки на

Сикачи – Алян Вил. (0.53), где отчетливо видно влияние рек Зея

и Бурея. Это говорит о преобладании в воде ароматических ГК

и ФК

терригенного происхождения, что может быть связано со стоком

водорастворимых и подвижных форм гумуса из иллювиального гумуса бурой тайги

и заболоченной почвы. которые распространены в бассейнах этих рек

[9].

Значения РО / ХПК для воды, вытекающей из озер

, варьировались в более узком диапазоне (0,35–0,5). Его значения

ед. Были максимальными в Ухтинском рукаве (0,58), что позволяет предположить, что в воде преобладают органические соединения

фунта гумусовой природы. Самые низкие значения были

, зарегистрированные в озере Петропавловское (0,3), что типично для воды

, которая содержит планктонный гумус с преобладанием алифатических соединений до

и, следовательно, имеет более низкую степень окисления перманганата

.

Большой интерес представляет оценка сброса

растворенного органического вещества из пойменных озер

в Амур. Это важно для изучения

процессов эрозии в его бассейне, круговорота углерода в природе

и экологической оценки водотока

. Качественные и особенно количественные характеристики стока ОВ

могут служить исчерпывающей оценкой состояния бассейна реки.Сток ОВ

оценен для основного канала Амур —

нель и пойменных озер (рис. 2, 3). Характеристика стока ОВ

имеет тенденцию к увеличению ниже по течению,

, что характерно для территорий с высоким боковым притоком

и значительными запасами подвижных форм ОВ в почвенно-растительном покрове

. Незначительное уменьшение стока

ОВ зафиксировано из Сикачи-Алян-Вил. (станция

тион 3) в Малмыж с.(ст. 9) с его дальнейшим увеличением на

в сторону ст. Нижняя Гавань. (станция 16).

Это может быть связано с большим влиянием сильно окрашенных

вод озер в этом районе, в частности, озера Удыл.

Максимальный сток ОВ для озер был зарегистрирован в профилях

динамического транскриптома, доступного генома и цистрома PGR в миометрии человека

Введение

Миометрий — мышечный компонент матки, состоящий в основном из гладких мышц и сосудистых клеток.Основная функция миометрия — поддерживать структурную целостность матки во время беременности и обеспечивать силу сокращения во время родов. Гладкомышечные клетки миометрия увеличиваются в количестве и в размере, а также переходят от синтетического состояния к сократительному во время беременности [1, 2]. Эти клетки должны оставаться в состоянии покоя перед родами и производить фазовые сокращения на стадии родов [3]. После родов процесс инволюции уменьшает размер матки до небеременного состояния [4, 5].Нарушения, связанные с миометрием, могут приводить к преждевременным родам, дистоции, аденомиозу и лейомиоме, которые создают серьезное бремя для здоровья матери и ребенка.

Стероидные гормоны прогестерон, эстроген и глюкокортикоид были показаны для регуляции экспрессии генов и пролиферации клеток гладкой мускулатуры миометрия [6-10]. Эстроген модулирует гены, связанные с сокращением, и вызывает гиперплазию гладкомышечных клеток миометрия на ранних сроках беременности, активируя путь PI3K / mTOR и подавляя экспрессию миостатина [7, 8, 11, 7].Эстроген также поддерживает рост клеток-предшественников миометрия [13] и работает вместе с прогестероном, способствуя пролиферации клеток боковой популяции лейомиомы посредством регуляции паракринной передачи сигналов WNT от зрелых клеток миометрия. [14]. С другой стороны, передача сигналов прогестерона подавляет экспрессию генов, которые связаны с пролиферацией клеток в культивируемых клетках миометрия человека, и оказывает негативное влияние на пролиферацию гладких мышц сосудов [9, 15, 16]. Напротив, глюкокортикоиды подавляют пролиферацию клеток лейомиомы матки, клеток гладких мышц сосудов и клеток гладких мышц дыхательных путей, но не влияют на развитие клеточного цикла в культивируемых клетках гладких мышц матки [6, 17, 18].Роль прогестерона и глюкокортикоидов в миометрии на ранних сроках беременности остается неизвестной.

Прогестерон также является одобренным FDA токолитическим средством для предотвращения преждевременных родов [19]. Передача сигналов прогестерона в первую очередь опосредуется рецептором прогестерона (PGR) и чувствительна к эндокринным разрушителям окружающей среды [16, 20]. Механизмы, которые контролируют передачу сигналов прогестерона, включают метаболизм прогестерона, регуляцию транскрипции и посттрансляционные модификации PGR и взаимодействие между PGR и корегуляторами [21-25].Перед родами передача сигналов прогестерона миометрия подавляет воспалительную и сократительную активности через путь ZEB1 / ZEB2-miR-200-STAT5b, PGR-AP-1, содержащий репрессивный комплекс транскрипции и зависимую от цАМФ-DUSP1 регуляцию фосфорилирования PGR [23, 26, 27] . При переходе к стадии родов, появляющиеся сообщения предполагают, что повышенное соотношение изоформы A PGR в стихе B может изменить эффект передачи сигналов прогестерона с репрессивного на индуктивный на транскрипцию генов труда, таких как GJA1, и дополнительно способствует соединению щелевых соединений в миометрии [ 27-29].Эти данные демонстрируют универсальность передачи сигналов прогестерона в биологии миометрия, проявляющуюся в активности его родственного рецептора PGR.

Это исследование фокусируется на физиологических изменениях между миометрием небеременных и доношенных беременных. Профили транскриптома, открытых участков хроматина и цистрома PGR в образцах миометрия человека на обеих стадиях документируются для выявления генетических путей и потенциальных основных механизмов, которые могут быть ответственны за структурную и функциональную адаптацию к беременности.Общие и отличные молекулярные особенности миометрия на этих двух стадиях не только обеспечивают клиническую значимость известных путей, но также предполагают новые механизмы, которые могут способствовать ремоделированию миометрия в поддержку беременности.

Материалы и методы

Образцы миометрия человека

Разрешение на работу с образцами тканей человека для всех экспериментов было получено от Институционального наблюдательного совета Медицинского колледжа Бейлора (BCM H-22119, утверждено 07.05.2008).Все образцы были получены из Гинекологического хранилища тканей для BCM, которому ранее было предоставлено разрешение на регулярный сбор образцов тканей женских половых путей в соответствии с отдельным протоколом IRB (H-33461). Письменное информированное согласие доступно для всех образцов, используемых для выполнения описанной работы.

Для целей этих экспериментов образцы миометрия были взяты у не рожающих беременных доношенных (TP; расчетный срок гестации 38-42 недели), перенесших кесарево сечение по обычным клиническим показаниям.Все образцы миометрия беременных женщин были взяты с краев гистеротомии после родов. У женщин, у которых в течение 6 часов после операции было увеличено количество родов, вызванных питоцином, или которые ранее получали 17-гидроксипрогестерон для лечения преждевременных родов, образцы не собирались. Кроме того, не собирались образцы у женщин, беременность которых осложнялась другими заболеваниями (включая, помимо прочего, гестационный диабет> IB, хориоамнионит, гипертензию, вызванную беременностью, преэклампсию, HELLP-синдром или его варианты).Образцы негравидного миометрия (НП) были получены от здоровых женщин в пременопаузе, перенесших обычную клинически показанную гинекологическую операцию. Все образцы негравидного миометрия были взяты из здорового миометрия в местах, которые исключали как серозную оболочку матки, так и эндометрий, и находились на расстоянии не менее 2 см от ближайшей лейомиомы. Любые образцы от женщин, принимавших прогестины до операции, были исключены из анализа.

После кратковременного промывания каждого образца в фосфатно-солевом буфере (PBS) кусочки миометрия либо мгновенно замораживали (ChIP-Seq), либо консервировали, погружая их в ледяной RNALater (RNA-Seq) с временем теплой ишемии менее 30 минут. .Впоследствии все образцы хранили при температуре <-80 ° C до использования. Анализы для каждого отдельного образца перечислены в таблице S1.

Экстракция РНК

Образцы миометрия гомогенизировали с помощью гомогенизатора bead Mill 24 (15-340-163, Fisher Scientific, Waltham, MA) в пробирках Bead Mill Tubes (15-340-154 Fisher Scientific, Waltham, MA) с 1 мл Trizol (15596026, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Тканевые остатки осаждали и удаляли центрифугированием при 12000 g в течение 10 минут при 4 ° C. После добавления 200 мкл 1-бром-3-хлорпропана образцы вручную встряхивали в течение 20 секунд с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 3 минут.Разделение фаз проводили центрифугированием при 12000 g в течение 18 минут при 4 ° C. РНК-содержащий водный слой сохраняли и затем смешивали с 500 мкл этанола крепостью 200 мкл. Затем смесь пропускали через колонку для связывания РНК в RNeasy Mini Kit (74104, Qiagen, Germantown, MD) с последующими этапами промывки и элюирования, описанными в руководстве производителя.

RNAseq

Библиотеки, полученные из образцов миометрия, секвенировали приблизительно с 50 миллионами считываний парных концов 101 п.н. на образец.Необработанные чтения были впоследствии обработаны фильтрацией со средним показателем качества выше 20. Затем чтения были согласованы с hg19 с использованием TopHat версии 2.0.4 [30]. Значения экспрессии RNA-seq выражали как значения FPKM (количество фрагментов на килобазу экзона на миллион фрагментов). Дифференциальное выражение было рассчитано с использованием Cufflink версии 2.2.1 [31]. Функциональный анализ списков генов был выполнен с использованием программ анализа пути изобретательности (IPA, www.ingenuity.com) и базы данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID) v6.8 [32, 33].

ATACseq

Три образца миометрия от небеременных (NP) и трех доношенных (TP) образцов миометрия были отправлены в Active Motif (Карлсбад, Калифорния) для службы подготовки библиотеки (каталожный номер 25079). Библиотеки были созданы с помощью набора для подготовки библиотеки ДНК Illumina Nextera и секвенированы с помощью Active Motif и ядра для секвенирования NIEHS с помощью систем Illumina HiSeq 2000 и NextSeq 500 с считыванием парных концов 42 п.н. на каждом образце. Необработанные чтения первоначально обрабатывались адаптерами обрезки и фильтрацией со средним показателем качества выше 20.Считывания, прошедшие начальную обработку, были сопоставлены с эталонным геномом человека (hg19) с использованием версии 1.1.2 Bowtie [34]. После удаления считываний, сопоставленных с митохондриальной ДНК, однозначно сопоставленные дедуплицированные считывания в каждом образце были нормализованы понижающей дискретизацией до 91,5 млн отдельных считываний. Для последующего анализа использовались только первые 9 пар оснований каждого считывания. Области открытого хроматина (OCR) были сначала идентифицированы MACS2 [35] с отсечкой скорректированного значения p 0,0001, с последующим слиянием геномных интервалов в пределах 100 пар оснований друг от друга.

Анализ мотивов и аннотация пиков для соседнего гена в пределах 25 КБ были выполнены с помощью инструмента обнаружения мотивов гипергеометрической оптимизации Motif EnRichment (HOMER) [36]. Алгоритм двумерного геномного следа (BaGFoot) [37] был использован для идентификации связывающих мотивов, демонстрирующих изменение доступности хроматина, включая глубину следа и доступность фланкирования между двумя стадиями миометрия.

ChIPseq

Иммунопреципитация хроматина, подготовка библиотеки и секвенирование были выполнены с помощью Active Motif (каталожный номер 25006 и 25046, Карлсбад, Калифорния) с использованием антитела против PGR (sc-7208, Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас) и специального Библиотека Illumina со стандартными адаптерами Illumina PE [38].Система Illumina HiSeq 2000 использовалась для секвенирования следующего поколения. Идентифицированные считывания односторонних последовательностей длиной 50 нуклеотидов были сопоставлены с геномной сборкой hg19 с использованием алгоритма BWA с настройками по умолчанию. В последующем анализе использовались только те считывания, которые прошли фильтр чистоты Illumina и имеют средний балл качества 20 или выше, выровнены не более чем с 2 несовпадениями и однозначно сопоставлены с геномом. Кроме того, если не указано иное, повторяющиеся чтения были удалены с помощью инструмента MarkDuplicates, доступного в picard-tools-1.119. Сохраненные сопоставления считываемых данных были отсортированы по координатам, расширены до 300 оснований, а затем случайным образом подвергнуты субдискретизации до 9 миллионов интервалов на выборку с использованием настраиваемых скриптов. MACS (версия 2.1.1.20160309) использовался для выполнения пикового вызова с отсечкой FDR на уровне 0,0001, используя вход миометрия человека в качестве контроля. Функции HOMER «annotatePeaks.pl» и findMotifsGenome.pl с настройками по умолчанию использовались для аннотации пиков и анализа обогащения мотивов заданных диапазонов пиков [36]. BEDTools версии 2.27.1 был выбран для слияния и пересечения пиков в анализе перекрытия с настройками по умолчанию [39].

ChIP-qPCR

ChIP-qPCR выполняли с помощью Active Motif (Карлсбад, Калифорния) с использованием антитела против PGR (sc-7208, Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас). Последовательности праймеров для анализа ЧИП-КПЦР являются ENO1_cF: AGCCCTTCCCCAATCATTAC, ENO1_cR: TACGTTCACCTCGGTGTCTG, LDHA_cF: GTGCATTCCCGGTACGGTAG, LDHA_cR: AGCAGAACCAGAGGCAGTTG, PLCL1_cF: GGAGAATGCGGGTCATCTTG, PLCL1_cR: CAGGAAACAAGCAGGAGTAGG и Untr12 (каталог # 71001, Активный Motif, Карлсбад, Калифорния). События связывания PGR рассчитывали в соответствии с уравнением, опубликованным в руководстве пользователя под каталожным номером Active Motif 12970399.

Количественная RT-PCR

кДНК была получена с помощью набора Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (0437

01, Roche Life Science, Penzberg, Germany) в соответствии с руководством производителя. ПЦР проводили с использованием SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (1725270, Bio-Rad, Hercules, CA) или SsoAdvanced Universal Probes Supermix (1725280, Bio-Rad, Hercules, CA) на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX Connect (1855201, Bio-Rad, Hercules, CA) согласно инструкции производителя.

праймеры, используемые в настоящем исследовании, включают OXTR_F: GGGGAGTCAACTTTAGGTTCG, OXTR_R: TTCCTCGGGATGTTCAGC, GJA1_F: GCCTGAACTTGCCTTTTCAT, GJA1_R: CTCCAGTCACCCATGTTGC, ZEB1_F: CCTAAAAGAGCACTTAAGAATTCACAG, ZEB1_R: CATTTCTTACTGCTTATGTGTGAGC, PLCL1_F: CAGGAAAAGATTGTACAGTGTCAGA, PLCL1_R: TTTGCCCCCAAATTATGAAG, SLC2A1_F: GGTTGTGCCATACTCATGACC, SLC2A1_R: CAGATAGGACATCCAGGGTAGC, HK2_F: GCTGAAGGAAGCGATCCA, HK2_R: GTGTCGTTCACCACAGCAAC, ALDOB_F: GGCAAGGCTGCAAACAAG, ALDOB_R: CCCGTGTGAACATACTGTCCT, PGK1_F: CAGCTGCTGGGTCTGTCAT, PGK1_R: GCTGGCTCGGCTTTAACC, ENO1_F: TCCCAACATCCTGGAGAATAA, ENO1_R: ATGCCGATGACCACCTTATC, PKM2_F: ACGTGGATGATGGGCTTATT, PKM2_R: CCAAGGAGCCACCATTTTC, LDHA_F: GTCCTTGGGGAACATGGAG и LDHA_R: TTCAGAGAGACACCAGCAACA.Зонд 18S рРНК предоставлен ThermoFisher Scientific (4319413E, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Все результаты ОТ-ПЦР были нормализованы к уровням экспрессии 18S рРНК внутреннего контроля.

Депозит данных высокого содержания

Необработанные данные RNAseq, ChIPseq и ATACseq находятся в SuperSeries GSE137552 в Омнибусе экспрессии генов Национального центра биотехнологической информации Национальной медицинской библиотеки.

Результат

Адаптивный транскриптом миометрия для беременности

Предыдущие исследования показали, что экспрессия генов, связанных с родами OXTR и GJA1 увеличивается, а ZEB1 и PLCL1 снижают экспрессию при переходе от состояния покоя к родам. миометрий беременной [40-43].После изучения 6 образцов миометрия у небеременных (NP) и 9 доношенных (TP) мы расширили эти результаты, продемонстрировав, что уровни мРНК OXTR, GJA1, ZEB1 и генов PLCL1 начинаются ниже в миометрии небеременных и повышаются к сроку. беременность (рисунок 1). Эти наблюдения предполагают, что транскриптом миометрия динамически меняется на протяжении беременности при подготовке к родам.

Относительные уровни мРНК с помощью qRT-PCR в тканях миометрия 6 (NP, точки) и 9 (TP, треугольники) людей. Ось Y обозначает относительные уровни мРНК. *, p <0,05 по двустороннему t-критерию. Оранжевые полосы обозначают среднее значение для каждой группы.

Полногеномная динамика транскриптома от стадии NP к стадии TP была дополнительно исследована с помощью RNAseq в когорте образцов миометрия, независимо от тех, что в вышеупомянутом исследовании маркерных генов (Таблица S1). Используя критерий среднего количества фрагментов на килобазу транскрипта на миллион картированных прочтений (FPKM), большее или равное 1, по крайней мере, в одном из шести образцов, в миометрии было обнаружено 15907 активных генов (Таблица S2).В каждой группе миометрий NP и TP каждый имеет 14899 и 15260 активных генов, соответственно (Таблица 1 и Таблица S2). Между этими двумя стадиями образцы NP и TP имеют 14612 активных генов (Таблица S2). В то время как 95,7% генов, экспрессирующих NP и 93,4% TP, присутствуют на обеих стадиях (таблица 1), общие профили транскриптомов демонстрируют значительную разницу, о чем свидетельствует анализ основных компонентов, который показывает четкое разделение между образцами стадий TP и NP (рисунок 2A). Эти данные предполагают, что зависимая от беременности динамика транскриптома в миометрии в первую очередь является результатом изменения уровней мРНК, а не состава экспрессирующих генов.

(A) Анализ основных компонентов транскриптомов NP (синий) и TP (красный). (B) Дифференциально экспрессируемые гены (DEG) между группами. Дифференциально экспрессируемые гены определяются как абсолютное кратное изменение ≥ 1,4, скорректированное значение p <0,05 и наличие FPKM ≥ 1 по крайней мере в одном из образцов.

Транскриптом миометрия человека у небеременных (NP) и доношенных (TP) людей.Гены с FPKM ≥ 1 по крайней мере в одном из образцов в каждой группе определяются как выраженные.

Используя абсолютное кратное изменение больше или равное 1,4 и скорректированное значение p меньше 0,05 в качестве отсечки, между двумя стадиями миометрия было идентифицировано 2890 дифференциально экспрессируемых генов (DEG) с относительно более высокой экспрессией 1043 и 1847 генов. в тканях NP и TP, соответственно (рис. 2B). Гены, связанные с родами, снова обнаруживают повышенную экспрессию к доношенной беременности в этой когорте особей со средними кратными изменениями в 156 раз для OXTR , 2.9 для GJA1 , 1,6 для ZEB1 и 2,6 для PLCL1 (таблица S2), что согласуется с предыдущими наблюдениями в другой когорте образцов (рисунок 1). Анализ онтологии генов на DEG показывает, что гены, экспрессируемые на более высоких уровнях на стадии NP, обогащены в терминах, связанных, среди прочего, с транскрипцией, связыванием РНК и активностью гистондеацетилазы, что отражает синтетическое состояние миометрия NP. Напротив, термины, связанные с врожденным иммунитетом, транспортом и метаболизмом протеаз и углеводов, чрезмерно представлены среди генов с более высокими уровнями экспрессии во время беременности (Таблицы 2 и S3), демонстрируя молекулярный профиль сократительного состояния в пользу контроля воспаления, внеклеточного ремоделирования. и повышенная потребность в энергии, а также подготовка к последующим родам.Дальнейшее изучение 2890o выявляет потенциальные изменения молекулярной активности между стадиями NP и TP, что предсказывается дифференциальной экспрессией нижестоящих генов-мишеней интересующих молекул. Анализ пути изобретательности (IPA) оценивает повышенную активность TGFβ, PDGF, ERK и STAT, связанных с расширением / ремоделированием миометрия, TNF и AP-1, связанными с управлением воспалением, а также передачу сигналов p53, связанных с сокращением миометрия (Таблица 3 и Таблица S4 ) [11, 44-49]. Изменения этих молекулярных активностей, по-видимому, эволюционно консервативны, о чем свидетельствует аналогичное наблюдение, которое сравнивает транскриптомные профили миометрия мышей между 18.Через 5 дней после полового акта и девственности (GSE17021, Таблица 3 и Таблица S5). Примечательно, что большинство подмножеств DEG, которые соответствуют IPA-курируемой глюкозе ниже по течению, демонстрируют изменения экспрессии генов, согласующиеся с ответом на лечение глюкозой (таблица 3, таблица S4 и таблица S5), что предполагает относительно более высокую утилизацию глюкозы на стадии TP. Этот результат также согласуется с вышеупомянутым обнаружением обогащения онтологии генов, как показано в Таблице 2. Более того, гены, которые кодируют ферменты пути гликолиза, включая SLC2A1, ALDOB, PGK1, ENO1, PKM2 и LDHA , показали повышенную мРНК. уровни к доношенной беременности в двух независимых когортах образцов (рисунок 3 и таблица S2).Ген HK2, который кодирует гексокиназу для фосфорилирования глюкозы, также показал значительно более высокие уровни экспрессии в миометрии TP в первой когорте, несмотря на то, что вместо этого показал тенденцию к увеличению во второй когорте (рис. 3). Более высокая экспрессия генов гликолитического пути и нижестоящих мишеней глюкозы вместе предполагает увеличение использования глюкозы в миометрии TP по сравнению с таковым на стадии NP. Взятые вместе, эти результаты иллюстрируют адаптивный транскриптом миометрия в ответ на беременность и при подготовке к родам в различных аспектах, таких как реорганизация структуры, управление воспалением и сокращением, а также метаболическая адаптация.

На диаграмме слева изображен путь гликолиза. (A) Результаты RNAseq. Желтым и синим цветом показаны соответственно высокий и низкий уровни экспрессии генов. (B-H) Относительные уровни мРНК в тканях из той же когорты людей, как показано на фиг.1. Ось Y обозначает относительные уровни мРНК. *, p <0,05 по двустороннему t-критерию. Оранжевые полосы обозначают среднее значение для каждой группы. N = 6 для НП и 9 для ТП.

Термины онтологии обогащенных генов в дифференциально экспрессируемых генах (DEG) между NP и TP миометрием.

Изменения молекулярной активности от NP к TP, предсказанные анализом пути изобретательности (IPA) на основе результатов человеческого РНКseq и мышиных микроматриц (GSE17021, девственный миометрий против 18,5 dpc).

Доступная динамика генома в миометрии

Поскольку профили транскрипции миометрия адаптируются к беременности, мы затем исследуем доступность генома миометрия, чтобы проверить, различаются ли также профили открытых участков хроматина между состояниями NP и TP. Анализ доступного для транспозаз хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq) [50] проводили на образцах миометрия трех человек на каждой стадии.Каждый NP и TP миометрий имеет 45501 и 85777 открытых участков хроматина (OCR), идентифицированных по крайней мере в одном из трех образцов в группе (рисунок 4 и таблица S6). Среди этих областей генома 9564 (класс I) и 50840 (класс III) OCR присутствуют исключительно в состояниях NP и TP соответственно, тогда как 35937 OCR (класс II) могут быть обнаружены в обоих состояниях (рис. 4). В каждом классе OCR HOMER идентифицировал обогащение 128, 82 и 121 мотивов связывания транскрипционного фактора в OCR класса I, II и III, соответственно (Таблица S7).Среди этих обогащенных мотивов 38, 2 и 12 мотивов демонстрируют обогащение, уникально присутствующее в OCR класса I, II и III, соответственно (Таблица 4). Гены, которые кодируют соответствующие факторы транскрипции для подавляющего большинства этих мотивов, обнаружены активными в тканях миометрия человека (Таблица S2), подразумевая, что на взаимодействия этих факторов транскрипции с геномной ДНК с высокой вероятностью может повлиять изменение структуры хроматина во время беременности.

Число участков открытого хроматина (OCR), идентифицированных в 3 NP и 3 TP образцах с помощью ATAC-seq. OCR внутри каждой группы были объединены. Также отмечается количество общих и уникальных OCR между выборками NP и TP.

Обогащенные мотивы в каждом классе участков открытого хроматина.

OCR класса I и III, расположенные в пределах 25 т.п.н. от сайтов начала транскрипции DEG, произвольно определены как DEG-ассоциированные динамические OCR (таблица 5), что делает эти OCR потенциальными регуляторными элементами генов для связанных DEG, находящихся под контролем хроматина. структурные изменения.Среди связанных OCR и DEG положительная корреляция наблюдается между 2989 OCR и 1461 DEG, которые имеют повышенную экспрессию генов, сопутствующую повышенной доступности генома или пониженную экспрессию генов с пониженной доступностью генома (Таблица 5). Это наблюдение предполагает, что эти 2989 OCR могут функционировать как предполагаемые энхансеры для 1461 ассоциированных DEG. С другой стороны, отрицательная корреляция наблюдается между 1660 OCR и 980 DEG, которые демонстрируют снижение экспрессии генов с увеличением доступности генома или увеличение экспрессии генов с уменьшением доступности генома (таблица 5).Эта обратная корреляция подразумевает роль этих 1660 OCR как предполагаемых репрессоров для 980 DEG. Анализ обогащения мотивов DEG-ассоциированных динамических OCR дополнительно выявляет кандидаты в регуляторы транскрипции, которые могут контролировать транскрипцию ассоциированных DEG и на действия которых, возможно, влияет изменение структуры хроматина в течение беременности (Таблица S8). Среди ДНК-связывающих белков, которые могут занимать эти обогащенные мотивы, рецептор эстрогена, рецептор глюкокортикоидов, рецептор прогестерона, факторы транскрипции MEF2C, NFAT, NFkB, AP-1 и STAT были изучены на предмет их роли в биологии миометрия [6, 51- 54]; а CTCF и YY1 известны своими функциями в регуляции конформации хроматина [55, 56].Присутствие этих мотивов в динамических OCRs предполагает, что изменения в структуре хроматина могут также влиять на действия этих регуляторов транскрипции и конформации хроматина в модуляции ассоциированных DEGs между двумя состояниями беременности. Дальнейшее изучение связанных DEG с помощью анализа обогащения онтологии генов обнаружило сигнальные пути, которые потенциально подвержены структурным изменениям хроматина, включая GTPases семейства Rho, актиновый цитоскелет, щелевые соединения, eNOS, релаксин, PDGF и HIPPO передачу сигналов для ремоделирования миометрия и регуляции сокращения, а также гликолиз и адреномедуллин для контроля метаболизма и кровообращения (таблица 6 и таблица S9).Таким образом, эти находки идентифицируют потенциальные сигнальные пути и их предполагаемые регуляторы транскрипции в миометрии человека, которые могут иметь дополнительный механизм контроля через доступность генома.

Области открытого хроматина I и III классов определяются как DEG-ассоциированные, если они расположены в пределах 25 т.п.н. от сайта начала транскрипции DEG. Положительная корреляция определяется, если 1. повышенная экспрессия гена и доступность генома в связанных областях открытого хроматина или 2.снижение экспрессии генов и доступность генома в связанных областях открытого хроматина. Отрицательная корреляция определяется, если: 1. сниженная экспрессия гена и повышенная доступность генома в связанных областях открытого хроматина или 2. повышенная экспрессия гена и пониженная доступность генома в связанных областях открытого хроматина. Все сравнения были сделаны TP над NP.

Избранные пути, связанные с изменениями статуса открытого хроматина. Анализ канонических путей IPA.

Данные ATAC-seq также позволяют оценить следы факторов транскрипции в открытых областях хроматина.Алгоритм двумерного геномного следа (BaGFoot) позволяет идентифицировать мотивы, которые расположены в углубленных участках следа связывания с белком (Δfootprint depth) в открытых областях хроматина, увеличивая доступность ДНК (Δ-фланкирующую доступность) из одного состояния в другое [37]. Ткани миометрия NP и TP демонстрируют различные наборы обогащенных мотивов (Рисунок S1 и Таблица S10). Соответствующие факторы транскрипции, которые могут занимать эти мотивы и также экспрессируются ALX1, ARID3A, FOXC1, FOXJ2, FOXJ3, HLF, HMGA1, HOXA13, HOXA5, HOXD9, NFIL3, NKX3.1, PBX1, POU6F1, PRRX2, REL и TBP для миометрия TP. Напротив, экспрессирующие регуляторы транскрипции, которые могут связываться с обогащенными мотивами в миометрии NP, включают EGR1, MDB2, MECP2, NRF1, SP1, SP2, SP3, SP4, ZBTB7B, ZBTB4 и ZNF219. Наши данные предполагают, что взаимодействия между этими факторами транскрипции и их геномными сайтами-мишенями в миометрии, вероятно, являются предметом изменения структуры хроматина на эпигеномном уровне при переходе к доношенной беременности.

Диаграмма мешка, отображающая изменение доступности ДНК (ΔFA) и изменение глубины следа связывания с белком (ΔFPD) от NP к этапам TP. Мотивы, имеющие статистическую значимость, отмечены красными квадратами.

Занятость генома PGR в тканях миометрия

Поскольку PGR играет жизненно важную роль в передаче сигналов прогестерона, и обогащение его мотива ДНК обнаружено в открытых областях хроматина миометрия, мы затем исследуем профили занятости генома PGR в миометрии в обоих случаях. Этапы НП и ТП.Биопсии миометрия от двух отдельных людей на каждой стадии подвергались анализу PGR ChIP-seq. Выявление пиков с использованием данных внутри каждого отдельного образца определяет интервалы занятия 24095, 9778, 10717 и 8053 PGR в образцах миометрия NP1, NP2, TP1 и TP2, соответственно, после нормализации до той же глубины секвенирования при 9 миллионах считываний на образец (Таблица S11). Эти области связывания PGR, представленные на каждой стадии, составляют 48,3% и 15,0% областей открытого хроматина в миометрии NP и TP, соответственно.Занятие PGR обогащено промоторами и 5′-нетранслируемыми областями (UTR) во всех четырех образцах миометрия за счет дистальных межгенных областей (Таблица 7), что предполагает тесное взаимодействие между PGR и аппаратом транскрипции вокруг промоторов in vivo для регуляция экспрессии генов. Примечательно, что увеличение занятости миометрия PGR вокруг промотора наиболее заметно в небеременном состоянии (34,3% для NP1 и 35,4% для NP2). С другой стороны, такое обогащение относительно ниже в состоянии TP (26.4% для TP1 и 12,0% для TP2) со сравнительно более высоким процентом связывания PGR в дистальной межгенной области (таблица 7). Это открытие указывает на то, что перераспределение занятости генома PGR происходит одновременно с ремоделированием миометрия и транскриптомными изменениями при адаптации к беременности.

интервала связывания PGR были аннотированы системой аннотаций цис-регуляторных элементов. Промотор определяется как область в пределах 3 т.п.н. выше сайта начала транскрипции.Под телом гена понимается интервал в пределах 3 т.п.н. ниже сайта терминации транскрипции.

Последовательности ДНК областей, занимающих PGR, показали значительное обогащение консенсусного мотива связывания PGR [57] во всех четырех образцах миометрия по сравнению с фоновым геномом (обогащение p , значение 1 x 10 ^-18 [NP1], 1 x 10 ^-686 [NP2], 1 x 10 ^-1105 [TP1], 1 x 10 ^-1059 [TP2], таблица S12), в то время как мотив консенсуса PGR чаще встречается в TP чем интервалы связывания PGR миометрия NP (21.33% [TP1] и 26,20% [TP2] против 5,01% [NP1] и 18,57% [NP2], таблица S12). Избыточное представительство связывающих мотивов для факторов транскрипции, которые имеют известные признаки в миометрии, также наблюдается во всех образцах миометрия, включая NR3C1 (рецептор глюкокортикоидов) [6, 58], ATF3 [59], FOSL1 [60], JUN [60] , KLF9 [61, 62], NF k B [63, 64] и STAT5 [54] (Таблица S12). Точно так же ДНК-связывающие мотивы для кофактора PGR FOSL2 [27, 57], регулятора дифференцировки гладких мышц TCF21 [65] и главного регулятора гладких мышц SRF (CArG) [66, 67] также чрезмерно представлены во всех образцах ( Таблица S12).Эти данные в совокупности показывают, что PGR может взаимодействовать с ДНК посредством как зависимых от консенсусных мотивов, так и независимых способов, и такое взаимодействие является динамичным во время ремоделирования миометрия. Более того, наши наблюдений in vivo обеспечивают клиническую релевантность предыдущим результатам in vitro о том, что PGR взаимодействует с другими известными факторами транскрипции миометрия и мышц в непосредственной близости от цис-действующих элементов для регуляции транскриптома миометрия.

Дальнейшее изучение данных по обогащению мотивов позволяет идентифицировать кандидатные факторы транскрипции, связанные с PGR, с миометрием, однако их функции в миометрии ожидают исследования.Белки TEAD, как известно, опосредуют путь Hippo для регуляции размера мышечных волокон [68] и взаимодействуют с факторами AP-1 для решения судьбы гладких мышц [69]. Мотив для факторов транскрипции TEAD чрезмерно представлен в интервалах связывания PGR во всех четырех образцах (таблица S12), а экспрессия TEAD1, TEAD2, TEAD3 и TEAD4 обнаруживается как в тканях миометрия NP, так и TP (таблица S2). Факторы транскрипции семейства BATF действуют как пионерный фактор, который контролирует доступность хроматина [70] и служат ко-регуляторами для PGR, NR3C1 и AP-1 [71-73].Связывающий мотив для BATF, членов суперсемейства AP-1, находится среди наиболее богатых мотивов в областях связывания PGR во всех четырех образцах миометрия (Таблица S12), а BATF, BATF2 и BATF3 все экспрессируются на обеих стадиях исследуемого миометрия ( Таблица S2). YY1, регулятор конформации хроматина и образования петель ДНК [56], обнаруживает адекватные уровни мРНК между стадиями NP и TP (Table S2). Интересно, что мотив связывания YY1 чрезмерно представлен вокруг сайтов связывания PGR образцов миометрия NP, но становится менее обогащенным по сравнению с фоном в образцах TP (обогащение p , значение 1 x 10 ^-55 [NP1], 1 x 10 ^-61 [NP2], 1 x 10 ^-20 [TP1],> 0.01 [TP2], таблица S12). Эти находки указывают на потенциальные взаимодействия PGR с сигнальным путем Hippo, воспалительным ответом и регуляторами конформации хроматина для контроля транскрипции in vivo . Более того, пример связанного со стадиями дифференциального обогащения мотива YY1 в интервалах связывания PGR предполагает, что PGR может работать с различными наборами факторов транскрипции, обеспечивая профили транскриптомов, специфичные для фенотипа.

Затем мы определяем общие и различные интервалы связывания PGR между образцами миометрия NP и TP.Пики связывания Union PGR в образцах были получены на основе всех интервалов связывания PGR в четырех образцах для документирования наличия и отсутствия каждого сайта связывания PGR в отдельных образцах. Всего найдено 30613 пиков связывания объединенных PGR (фиг. 5 и таблица S13). Количество объединяющих пиков, присутствующих в каждом образце, составляет 24019, 9491, 10402 и 7928 для NP1, NP2, TP1 и TP3 соответственно (рис. 5). Ткани миометрия NP1 и NP2 имеют 7323 пика слияния, в то время как это число между TP1 и TP2 составляет 4839 (Рисунок 5).Среди этих 7323 пиков в миометрии NP, связывающие мотивы PGR, факторов транскрипции STAT, SRF, MyoD и SMAD2 чрезмерно представлены (Таблица 8 и Таблица S14). Обогащение этими мотивами также обнаруживается среди 4839 сайтов, занимающих PGR в TP миометрии (Таблица 8 и Таблица S14). В соответствии с результатами анализа мотивов на отдельных образцах (Таблица S12), консенсусный мотив PGR демонстрирует более высокие уровни обогащения PGR, занимающим интервалы миометрия TP, по сравнению с таковым на стадии NP (Таблица 8).Кроме того, мотивы STAT, CArG и SMAD2 также демонстрируют повышенное обогащение в миометрии TP, в то время как мотив MyoD имеет более сильное избыточное представительство в образцах NP (Таблица 8 и Таблица S14). Эти наблюдения указывают на то, что регулировка партнерства с другими факторами транскрипции на разных стадиях является обычным процессом среди особей за пределами индивидуальных вариаций.

PGR ChIP-seq был выполнен в двух отдельных образцах на этапах NP или TP.Диаграмма Венна цветка показывает количество перекрывающихся и различных участков, занимающих PGR, среди четырех экземпляров.

Отобранных обогащенных мотивов в общих интервалах связывания PGR на каждой стадии.

Дальнейшее изучение связанных со стадией областей, занимающих PGR, выявило 2220 геномных областей, которые являются общими между 7323 и 4839 интервалами связывания PGR, в то время как 2773 и 1047 имеют отчетливое присутствие в миометрии NP и TP, соответственно (Рисунок 5). Помимо различий в геномных положениях, составы мотивов связывания факторов транскрипции также демонстрируют расходящиеся профили среди этих трех групп областей, занимающих PGR (Таблица S15).Среди 95 мотивов, которые составлены из 50 верхних обогащенных мотивов каждой из трех групп, значения p обогащения выявляют существенное различие в степени представления этих мотивов между NP-отличными и TP-отличными регионами, занимающими PGR (рис. 6). Отдельные области TP сильно обогащены консенсусными связывающими мотивами для рецепторов прогестерона и глюкокортикоидов, белков AP-1 и факторов транскрипции TEAD, в отличие от относительно более низкого обогащения в отдельных областях NP.Напротив, отдельные сайты NP обнаруживают сильные сверхпредставления в мотивах факторов транскрипции ETS, фактора ядерной транскрипции Y, CTCF, YY1, Sp1 и NRF1, которые гораздо меньше обогащены отдельными участками TP. Примечательно, что 2220 общих областей имеют профиль обогащения мотивов, подобный профилю TP, а не отдельным областям NP (Рисунок 6). Это указывает на то, что PGR на стадии NP может взаимодействовать с более широким спектром регуляторов транскрипции, тогда как он, вероятно, работает с более сфокусированным набором факторов транскрипции в миометрии TP.В совокупности данные предполагают, что динамика мест связывания PGR между двумя состояниями миометрия позволяет различным комбинациям мотивов связывания факторов транскрипции, доступных для соответствующих регуляторов, взаимодействовать с PGR специфическим для состояния образом.

50 лучших мотивов из каждой группы собираются и отображаются со значениями log p.Цветовые коды изображены в виде красно-бело-синего рисунка, при этом красный цвет показывает самое сильное обогащение, а синий — наименее обогащенное.

Кандидатные гены-мишени PGR, непосредственно расположенные ниже по течению в миометрии

Связь между занятостью генома PGR и транскриптомом миометрия оценивается путем определения ближайших генов к 2220 общим и 2773 и 1047 различным интервалам связывания PGR между NP и TP миометрием. Среди этих 6040 областей, занимающих PGR, 4355 (72%) связаны с 2203 активными генами миометрия (Таблица 9 и Таблица S16).Эти 2203 гена-кандидата PGR, непосредственно расположенного ниже по течению, могут быть дополнительно подразделены на 1431 NP-отличных, 183 TP-отличных и 589 NP-TP общих активных генов на основе их ассоциации с отдельными или общими интервалами связывания PGR (Таблица 9), в которых Анализ пути изобретательности идентифицировал 51, 37 и 166 канонических сигнальных путей, соответственно, которые имеют значение обогащения p менее 0,05 (Таблица S17). Профили 50 основных ассоциированных путей из каждой из трех групп проявляются в разных профилях (рис. 7).Известные примеры путей, которые селективно обогащены в отдельных группах, включают «передачу сигналов рецептора эстрогена» и «передачу сигналов метилирования ДНК и репрессии транскрипции» для отдельной группы NP, «передачу сигналов IL-10» и «ингибирование матричных металлопротеаз» для отдельной группы TP, и «передача сигналов актинового цитоскелета» и «передача сигналов р53» для общей группы NP-TP (рисунок 7 и таблица S17). Напротив, ни один канонический путь не имеет значения обогащения p менее 0,05 во всех трех группах.Эти данные предполагают, что каждая группа областей связывания PGR может вносить вклад в регуляцию когорты генов, которые обслуживают определенные функции физиологической адаптации во время беременности.

Лучшие 50 обогащенных путей из анализа пути изобретательности из каждой группы компилируются и отображаются со значениями log p. Цветовые коды изображены в виде красно-бело-синего рисунка, при этом красный цвет показывает самое сильное обогащение, а синий — наименее обогащенное.

Связь между занятостью PGR и активными генами миометрия. Список ближайших генов к 2220, 7323 и 4839 разделяемым и различающимся интервалам занятия PGR был идентифицирован и дополнительно отфильтрован с критериями наличия максимального значения FPKM больше или равного 1 среди 6 образцов миометриальной RNAseq для каталогизации активных PGR-ассоциированных гены.

Занятость PGR в областях генома в ассоциации с интересующими генами дополнительно исследуется на дополнительных образцах миометрия, по два каждый из стадий NP и TP (Таблица 10).Гликолитические гены ENO1 и LDHA демонстрируют пониженное количество событий связывания в миометрии TP по сравнению с таковым в NP. Учитывая, что оба гена демонстрируют более высокие уровни экспрессии в образцах TP (Рисунок 3), эти данные вместе указывают на отрицательную корреляцию между занятостью PGR и уровнями мРНК. PLCL1 ослабляет простагландин-зависимую передачу сигналов кальция (патент США 20160161487A1). PLCL1 экспрессируется в миометрии человека (Рисунок 3 и Таблица S2) [40] и является мишенью для PGR ниже по течению [74].Занятие PGR в области 93kb выше гена PLCL1 может быть обнаружено в обеих когортах образцов миометрия (таблица 10 и таблица S13), которая может служить функциональным регуляторным элементом для гена миометрия PLCL1 . Хотя были протестированы только несколько областей генома, воспроизводимое определение занятости PGR в разных когортах образцов миометрия подтверждает результаты ChIP-seq для всего генома. Более того, эти находки также идентифицировали кандидатные цис-действующие элементы, с помощью которых PGR может регулировать экспрессию гликолитических генов ENO1 и LDHA , а также связанного с сократимостью гена PLCL1 .

Занятость PGR в выбранных геномных локусах во второй когорте образцов миометрия. ChIP-qPCR выполняли в отдельном наборе тканей миометрия NP (n = 2) и TP (n = 2) для теста занятости PGR. Выполняли технические трижды для каждой реакции qPCR, и среднее значение и стандартное отклонение трех повторностей использовали для расчета событий связывания PGR. Untr12, расположенный в генной пустыне, служит отрицательным контролем.

Обсуждение

Новизна исследования

Настоящее исследование документирует молекулярный ландшафт NP и TP миометрия, а также изменения между этими двумя стадиями.В то время как предыдущие полногеномные исследования выявляют механизмы-кандидаты для перехода от нерабочего к родовому состоянию [40, 75, 76], представленные здесь результаты показывают, как миометрий реорганизуется и адаптируется от небеременного к беременному перед переключением на роды. Это иллюстрируется равномерным увеличением мРНК генов, связанных с родом, OXTR, GJA1, ZEB1 и PLCL1 во время ремоделирования миометрия с последующим дивергентным изменением паттернов экспрессии (Рисунок 1).Наши данные транскриптома расширяют спектр знаний о динамике экспрессии генов миометрия и закладывают основу для будущего метаанализа, чтобы понять генетическую программу ремоделирования миометрия во время цикла беременности. Выявленные здесь молекулярные пути также могут служить ориентиром для изучения генетических и экологических воздействий, которые подрывают нормальную беременность, приводя к таким заболеваниям, как преждевременные роды и дистоция.

Оценочные карты генома предлагают план для изучения генетической и эпигенетической регуляции транскриптома миометрия.Идентифицированные открытые области хроматина, вероятно, содержат цис-действующие элементы, которые участвуют в регуляции транскриптома миометрия, и они могут подлежать эпигенетическому контролю. Например, связывающие мотивы рецептора эстрогена и регулятора клеточного цикла E2F1 чрезмерно представлены в открытых областях хроматина, обнаруженных только в миометрии NP (Таблица 4), что отражает более высокие уровни экспрессии генов для транскрипции и контроля генов (Таблица 4). 2) и подразумевает подготовку пролиферации гладких мышц к расширению миометрия на ранних сроках беременности под контролем рецептора эстрогена.Другой пример — ген MEF2A, связанный с родами [51]. Обогащение связывающего мотива MEF2A в открытых областях хроматина класса III (Таблица 4) указывает на то, что доступность MEF2A к его сайтам-мишеням может быть другим уровнем регуляции его действия в дополнение к изменениям в уровнях экспрессии [51]. Наш полногеномный интегративный анализ доступности генома и транскриптома выявил потенциальные регуляторные элементы и связанные с ними молекулярные пути, которые могут влиять на доступность хроматина (таблица S8 и таблица S9).Эти данные открывают путь к дальнейшему углубленному изучению эпигенетического воздействия на изменения транскриптома миометрия.

Учитывая, что прогестерон является основным стероидным гормоном для беременности и имеет клинические показания для предотвращения преждевременных родов, сфокусированное исследование занятости миометрия PGR по всему геному предоставляет карту для определения цис-действующих элементов, связанных с PGR, и их возможных нижестоящих целевых генов дальнейшее исследование механизма действия PGR. Примечательно, что влияние потери маточного p53 на продолжительность беременности было описано на модели мышей [49].В нашем исследовании «передача сигналов p53» является одним из наиболее обогащенных путей в предполагаемых прямых последующих мишенях PGR (Таблица S17). Это открытие предполагает потенциальное взаимодействие между передачей сигналов PGR и p53 в миометрии. Между тем, чрезмерно представленные мотивы связывания факторов транскрипции, окружающие сайты, занимающие PGR, указывают на потенциальных партнеров, взаимодействующих с PGR для регуляции генов миометрия. Например, известно, что белки AP-1 являются партнерами PGR для регуляции генов, что подтверждается несколькими генами, производящими роды [27].Мы обнаружили, что связывающие мотивы многих субъединиц AP-1 являются одними из самых богатых мотивов в областях, занимающих PGR миометрия (Таблица S14 и Рисунок 6), что указывает на потенциальное общегеномное партнерство между PGR и AP-1. Наши результаты не только обеспечивают соответствие человека известным сигнальным путям на уровне in vivo , но также позволяют идентифицировать новые мишени, работающие с PGR или находящиеся под их контролем, для будущих исследований.

Показания рецептора прогестерона на метаболизм и ремоделирование миометрия

Повышенная экспрессия генов гликолитического пути и продукции лактата к доношенной беременности имеет два физиологических значения.Во-первых, это производство лактата и сократимость миометрия. Лактоацидоз миометрия наблюдается у женщин с дисфункциональными родами [77]. Было показано, что кислый pH отменяет сокращение миометрия [78]. Лечение лактатом может уменьшить спонтанные сокращения [79] и подавить воспаление матки и преждевременные роды [80]. Лактат превращается из продукта гликолиза пирувата в мышечной системе с помощью лактатдегидрогеназы. Снижение экспрессии в мышцах Ldha , кодирующей субъединицу лактатдегидрогеназы, приводит к снижению конверсии пирувата в лактат [81].Наши транскриптомные данные показывают, что путь гликолиза и выработки лактата настроен на повышение способности обработки к доношенной беременности (рисунок 3 и таблица S2). Более того, более высокая утилизация глюкозы миометрием при доношенной беременности также подтверждается изменением характера экспрессии генов, чувствительных к глюкозе (Таблица S4 и Таблица S5). Наши результаты показывают, что во время беременности транскриптом миометрия приспосабливается к увеличению способности продуцировать лактат, что способствует поддержанию покоя миометрия.Второе замечание касается энергетического обмена и молекулярного биосинтеза. Наши транскриптомные данные показывают, что в миометрии TP увеличение молекулярной активности HIF1A, вероятно, происходит на основе характера экспрессии нижестоящих мишеней HIF1A (Таблица S4 и Таблица S5). Повышение активности HIF1A указывает на гипоксический миометрий в срок. В анаэробных условиях повышенный гликолиз может генерировать АТФ, чтобы компенсировать потребность в энергии для поддержания клеточных функций. С другой стороны, при нормоксии повышенная способность к более высокому потоку гликолиза может поставлять промежуточные продукты для синтеза аминокислот, чтобы генерировать строительные блоки для расширения миометрия в течение беременности.Повышенная экспрессия гликолитического гена во время беременности соответствует этим гипотезам об изменении функций миометрия (рис. 3). Наконец, связывание PGR в геномных локусах ENO1 и LDHA связывает PGR с регуляцией метаболизма миометрия (Таблица 10), что требует дальнейших исследований.

Ограничение и будущее направление

Разрешение данных молекулярного профилирования и интеграция мультиомной информации — два основных ограничения, существующих в настоящем исследовании. Данные по всему геному здесь представляют собой сводное наблюдение за многими клетками, которые находятся в частях тканей миометрия.Хотя гладкомышечные клетки составляют большую часть массы, показания других типов клеток, таких как клетки крови и сосудов, также включаются как часть сводных результатов, что может снизить отношение сигнал / шум информации о клетке. тип интереса. Несмотря на потенциальный вклад транскриптов других типов клеток, данные транскриптома миометрия демонстрируют сильную связь с известными программами гладких мышц и миометрия (таблица 2 и таблица 3), данные ATACseq устанавливают тесную связь между предполагаемыми цис-действующими элементами и сигнальными путями для мышечных функций. (Таблица 6), а данные цистрома PGR обнаруживают обогащение связывающих мотивов для главных регуляторов гладких мышц SRF и MyoD (Таблица 8).Эти примеры демонстрируют, что текущие данные могут предоставить важную информацию в поддержку существующих знаний и предоставить новые результаты. Новые методы молекулярного профилирования на уровне отдельных клеток обеспечат более высокое разрешение, чем текущие результаты, полученные с помощью более устоявшихся технологий, что приведет к дальнейшему изучению роли каждой клетки и лежащих в основе молекулярных событий в данном состоянии миометрия.

Еще одним ограничением разрешения данных является то, что антитело, используемое для генерации текущих результатов PGR ChIPseq, выявляет обе основные изоформы PGR в миометрии, PGR-A и PGR-B.Эти две изоформы PGR отличаются доменом трансактивации AF-3, который существует только в PGR-B. Обе изоформы функционально способны модулировать транскрипцию общих и различных наборов нижестоящих генов в зависимости от контекста [25]. Следовательно, стехиометрическое соотношение между двумя изоформами на разных стадиях миометрия необходимо учитывать при интерпретации эффекта PGR на экспрессию связанных генов. Для исследований тканей человека существует острая необходимость в разработке специфичных для изоформ антител к PGR, возможно, посредством нацеливания на белковые домены с конформациями, специфичными для изоформ.

Что касается ограничения интеграции мультиомической информации, в этой рукописи исследование занятости PGR и ассоциации транскриптома миометрия основано на строгом критерии, который связывает только один ближайший ген с каждым отдельным сайтом, занимающим PGR (Таблица 9). Обоснование использования такого строгого критерия основано на наблюдении, что большинство сайтов, занимающих PGR, расположены рядом с телами генов (Таблица 7). Цис-действующие элементы, оккупированные PGR, вероятно, оказывают большее влияние на транскриптом миометрия в соответствии с появляющимися моделями контроля транскрипции, согласно которым каждый ген подлежит регуляции множественными энхансерами и наоборот в топологически ассоциированном домене, образованном посредством конформации хроматина [82, 83].Будущая интеграция данных о конформации хроматина, полученных с помощью высокопроизводительного анализа конформации хроматина, позволит лучше назначить связывающие PGR цис-действующие элементы с ассоциированными генами, особенно в отношении взаимодействий на больших расстояниях, чтобы обеспечить корреляционную информацию, более близкую к истинным молекулярным событиям.

Таблица S1. Список образцов миометрия человека.

Таблица S2. Активные гены в миометрии человека

Таблица S3. Полный список анализа генной онтологии в таблице 2.

Таблица S4. Прогнозируемые молекулярные активности с помощью анализа пути изобретательности, дифференциально экспрессируемые гены в миометрии человека NP и TP.

Таблица S5. Прогнозируемые молекулярные активности с помощью анализа пути изобретательности на дифференциально экспрессируемых генах между 18,5 dpc и миометрием девственной мыши (GSE17021).

Таблица S6. Координаты генома участков открытого хроматина в образцах миометрия человека. «1» и «0» обозначают присутствие и отсутствие, соответственно, в миометрии NP и TP.Классы определены на рисунке 4.

Таблица S7. Анализ обогащения мотивов с помощью известного мотива HOMER в трех классах участков открытого хроматина, которые определены на фиг. 4.

Таблица S8. Анализ обогащения мотивов на динамических OCR, связанных с DEG

Таблица S9. Canonical Pathways, которые связаны с DEG, связанными с динамическими OCR.

Таблица S10. Оценка транскрипционного следа в образцах миометрия NP и TP с помощью BaGFoot.

Таблица S11. Координаты генома (Hg19) PGR, занимающие интервалы в тканях миометрия четырех человек.

Таблица S12. Обогащенные мотивы в каждом отдельном образце миометрия. Данные взяты из выходных файлов алгоритма поиска неизвестных мотивов HOMER.

Таблица S13. Информация о пиках Union об интервалах связывания PGR во всех четырех образцах миометрия. В разделе «UnionPeak-vs-Sample» 1 и 0 обозначают наличие и отсутствие пика связывания PGR в каждом отдельном образце.

Таблица S14. Обогащенный анализ 428 мотивов связывания факторов транскрипции в общих сайтах, занимающих PGR, на каждой стадии образцов миометрия.

Таблица S15. Обогащающий анализ 428 известных мотивов связывания факторов транскрипции в общих и различных областях, занимающих PGR, между группами NP и TP.

Таблица S16. Связь между занятостью PGR и активными генами миометрия

Таблица S17. Канонические пути в связи с занятостью PGR и активными генами миометрия.1431, 589 и 183 активных гена, которые связаны с NP-отличными, общими NP-TP и разными TP-занимающими сайтами PGR, как показано в таблице 9, были подвергнуты анализу пути изобретательности.

10 лучших мест, где можно поесть на острове Исигаки-дзима, Окинава

Остров Исигаки — это место, где вам нужно остановиться, чтобы посетить более отдаленные острова, такие как остров Такето или остров Ириомотэ. По этой причине не многие проводят много времени на самом острове Исигаки. Однако здешнюю кухню обязательно стоит попробовать! Просто сдать его другим островам — пустая трата времени.Остановитесь подольше, чтобы насладиться всем, что может предложить остров Исигаки. Сегодня мы покажем вам, где нужно поесть.

1. Кунацую

фото kurominchan / встроено из Instagram

Яэяма соба — окинавская соба, которой можно насладиться в районе Яэяма. Лучшее место, чтобы насладиться этой соба — здесь, в Куцунаю. Внешний вид ресторана выглядит как традиционный дом и отмечен каменной стеной и гибискусами. Соба, которой можно наслаждаться здесь, тонкая, круглая и прямая, в прозрачном супе с четким привкусом бульона.В отличие от окинавской соба, эта соба украшена тонко нарезанной свининой и рыбной чепухой, но не включает маринованный имбирь.

Если у вас есть дополнительное место, наслаждайтесь набором Яэяма Соба. В этом блюде рыдания сопровождают особые предметы. Лесная атмосфера магазина очень расслабляет. Поскольку часы короткие, мы рекомендуем вам выйти пораньше, чтобы вы могли получить здесь максимум удовольствия.

2. Исигакия

, фото im.winnie / встроено из Instagram

Говядина Исигаки продается по всей стране. Говядина конкретной марки должна выращиваться в районе Яэяма в течение отведенного времени и быть разновидностью с черным покрытием.

Если вы хотите съесть эту говядину, мы рекомендуем этот специализированный магазин. Наслаждайтесь говядиной высочайшего качества от этой особой марки благодаря предлагаемым здесь блюдам.Вы можете полакомиться стейком из вырезки, филейной частью и специальной верхней тарелкой.

Помимо говядины исигаки, вы также можете попробовать местную курицу и островные овощи. Независимо от того, что вы заказываете, вы можете насладиться вкусной едой, которую производит Исигаки. Магазин также сделан из специального дерева, и созданная атмосфера не будет забыта. Наслаждайтесь здесь роскошной говядиной.

▽ Связанная статья

3. Funakuranosato

, фото edwardyue / встроено из Instagram

Место для этого ресторана очень просторное, а здания состоят из множества разных старых домов.Здесь вы можете насладиться атмосферой Яэямы с помощью 5 чувств. Вечером вы можете насладиться местной кухней, но мы также можем порекомендовать блюдо соба на обед за 1800 иен. Домашняя лапша — центральный элемент, который подается с натуральными мозуку, мимига и дзимами тофу (арахисовый тофу). Вы также можете насладиться индивидуальными блюдами, если захотите.

Каждый вечер в одном из зданий звучит живая музыка с песнями и окинавским трех-проводным инструментом. Если вы хотите насладиться живой музыкой и ужином, обязательно забронируйте места заранее!

4.Тофу но хига

фото skyhigh_life / встроено из Instagram

Этот магазин расположен посреди полей сахарного тростника. Здесь готовят тофу более 60 лет назад. Их фирменное блюдо — творожный тофу. Придя в магазин, вы будете ориентированы в одном из двух направлений по указателям «Те, кто любит тепло» и «Те, кто слаб к теплу». В зависимости от того, какой способ вы выберете, вам предложат сидеть на улице или в помещении.

Меню очень простое с «Пушистым сетом из тофу», «Пушистым тофу соба» и «Тофу с перемешиванием».Вы можете выбрать «Старший пушистый тофу» за 350 иен! Он поставляется с рисовой кашей, яичным рулетом и творогом. Хорошая новость в том, что вам не обязательно быть взрослым, чтобы насладиться этим потрясающим меню по этой потрясающей цене. Это нежное блюдо подойдет для утомленного от путешествий желудка.

5.Hitoshi

фото kazutaka / встроено из Instagram

Если вы хотите отведать магуро (тунца) на острове Исигаки, вам сюда. Он действительно оправдывает свое название «специализированный магазин Maguro».

Иногда это может быть невозможно из-за условий улова, но если вы можете, мы рекомендуем вам попробовать «Магуро суши». Подают свежий тунец каждого сорта жирности. С 4 кусками обычных суши и 6 кусками суши в обертке за 980 иен это прекрасное предложение.Еще один популярный пункт меню — «Суши с говядиной Исигаки».

Текстура мяса тает во рту. Замечательно то, что, несмотря на то, что используется говядина марки Ishigaki, она не продается по такой экстравагантной цене. При посещении обязательно попробуйте эти два предмета.

Ассорти сашими тоже замечательное и в хорошем количестве. В этом магазине продают не только магуро, но и другую рыбу по очень разумным ценам. Здесь всегда многолюдно, поэтому обязательно бронируйте столик.

▽ Связанная статья

→ 10 лучших суши-ресторанов Окинавы

Вам также может понравиться:

→ 10 лучших мест на Окинаве

6. Island Vegetable Café Hellow Beach

, фото motiti_26 / встроено из Instagram

Как видно из названия, это место, где в блюдах много островных овощей. Вы можете сидеть внутри на татами или на террасе с видом на океан.На доске указано, где выращивают овощи. Вы можете быть уверены, что овощи были приготовлены в экологически чистой среде на острове, и наслаждайтесь ими, пока не насытитесь. Все блюда, включая карри, локо-моко и гамбургер, прекрасны.

Между 11:00 и 15:00. время обеда. В это время в баре с напитками можно заказать чай Pineapple Sanpin, ароматный чай и кофе. Вы также можете насладиться белым вином из Калифорнии! В кафе вы можете выпить один напиток по вашему выбору, а во время ужина вас ждет шведский стол с овощами, которые вы можете съесть.Каждый раз в течение дня предлагает что-то новое, и вам захочется посетить несколько раз!

7. Пэнгин Сёкудо

фото tn22408 / встроено из Instagram

Здесь вы можете насладиться овощами и тофу с острова. Они также использовали пищевое масло чили, получившее национальную известность на острове Исигаки. На этом острове используется перец чили, куркума, островной кунжут и коричневый сахар. Для создания этого соуса используется более десяти уникальных окинавских ингредиентов.Обычно соус чили используется только с наклейками для свиных горшочков. Однако здесь он используется во многих различных блюдах, таких как овощи и мясо, тофу и лапша.

Блюда здесь полностью ручной работы и, следовательно, не безграничны. Поэтому обязательно забронируйте место заранее. Приходите насладиться восхитительными блюдами с маслом чили с острова Исигаки.

8. Ичигойчи

, фото h_kathy2.0 / встроено из Instagram

Здесь можно отведать восхитительные морепродукты на острове Исигаки. Эту рыбу привозят сюда свежей с рыбацкой лодки «Шиосаймару», и она представлена ​​в самых разных формах. То, что мы можем порекомендовать, зависит от улова дня, но вы всегда захотите попробовать «Шиосайское блюдо».

Есть также блюда, не относящиеся к морепродуктам, такие как жаркое из горьких огурцов, тушеные кубики свинины в окинавском стиле и модзуку.Вы также можете отведать кокосового краба и сашими из гигантского моллюска. Если есть предметы, с которыми вы не знакомы, начните с их заказа! Также можно заказать пиво Orion, пиво Ishigaki Island и другие алкогольные напитки. Каждый вечер здесь звучит живая музыка, так что приходите насладиться изобилием острова Исигаки под музыку острова Исигаки.

▽ Связанная статья

9. Okashi no Marche

, фото kanabun720 / встроено из Instagram

Кунпен — очень популярный сувенир острова Исигаки.Когда вы пишете китайскими иероглифами, это означает «ароматные рисовые лепешки». Если вы это знаете, вы могли бы стать профессионалом на острове Исигаки. В прошлом это было деликатесом для королей королевства Рюку. Это восхитительное угощение, которое обязательно вам понравится.

Они производятся и продаются Миядзаки Окашитеном с 1922 года. Снаружи они похожи на печенье, а аромат — запах арахиса и кунжута. В этом магазине вы также можете отведать более 20 видов тортов и слоеных кремов.Также есть более 30 предметов, которые могут стать отличным сувениром с острова Исигаки. Приходите сюда, чтобы попробовать вкусные угощения и все свои сувениры!

▽ Связанная статья

→ 10 лучших десертных магазинов Окинавы

10. ГРИЛЬ УГЛОВОЙ

фото от modokame / встроено из Instagram

JA Говядина исигаки используется в стейках и гамбургерах в CORNER’S GRILL. Пункт меню, который вы не захотите пропустить, посетив здесь, — это гамбургер со 100% говядиной исигаки! Пирожок 150 г и довольно большой. Вы можете съесть его с авокадо и сыром за 2050 иен, но если учесть, что он на 100% местный, это вполне выгодно. Это блюдо обязательно вам понравится.

Есть также другие гарниры, такие как луковые кольца и чесночные креветки. Вы также можете взять чизбургер и сырный бургер с авокадо в зависимости от условий производства говядины на острове. Если у вас нет времени, вы можете купить его перед полетом, чтобы не пропустить этот удивительный опыт!

Приходите насладиться изысканными блюдами острова Исигаки!

Что вы думаете？ Несомненно, одна из роскоши отпуска — это кухня.Каждый хочет попробовать местную кухню. Когда вы посетите остров Исигаки, обязательно попробуйте блюда, которые доступны только здесь. Вы обязательно найдете нового чудесного фаворита и оставите незабываемые воспоминания.

% PDF-1.4 % 1086 0 объект > эндобдж xref 1086 193 0000000016 00000 н. 0000007732 00000 н. 0000007840 00000 н. 0000008137 00000 п. 0000008762 00000 н. 0000009501 00000 п. 0000009912 00000 н. 0000009967 00000 н. 0000010189 00000 п. 0000010405 00000 п. 0000010638 00000 п. 0000011276 00000 п. 0000011742 00000 п. 0000012143 00000 п. 0000012532 00000 п. 0000012914 00000 п. 0000013557 00000 п. 0000014223 00000 п. 0000014829 00000 п. 0000014891 00000 п. 0000015057 00000 п. 0000015193 00000 п. 0000015320 00000 п. 0000015451 00000 п. 0000015605 00000 п. 0000015770 00000 п. 0000016003 00000 п. 0000016156 00000 п. 0000016312 00000 п. 0000016468 00000 п. 0000016617 00000 п. 0000016837 00000 п. 0000016990 00000 н. 0000017146 00000 п. 0000017288 00000 п. 0000017407 00000 п. 0000017561 00000 п. 0000017715 00000 п. 0000017861 00000 п. 0000018014 00000 п. 0000018168 00000 п. 0000018330 00000 п. 0000018463 00000 п. 0000018616 00000 п. 0000018772 00000 п. 0000018960 00000 п. 0000019192 00000 п. 0000019404 00000 п. 0000019527 00000 н. 0000019683 00000 п. 0000019848 00000 н. 0000019971 00000 п. 0000020125 00000 н. 0000020258 00000 п. 0000020390 00000 н. 0000020543 00000 п. 0000020709 00000 п. 0000020942 00000 п. 0000021084 00000 п. 0000021237 00000 п. 0000021393 00000 п. 0000021547 00000 п. 0000021700 00000 п. 0000021856 00000 п. 0000022003 00000 п. 0000022154 00000 п. 0000022373 00000 п. 0000022483 00000 п. 0000022606 00000 п. 0000022760 00000 п. 0000022928 00000 п. 0000023086 00000 п. 0000023275 00000 п. 0000023432 00000 п. 0000023651 00000 п. 0000023778 00000 п. 0000024006 00000 п. 0000024243 00000 п. 0000024402 00000 п. 0000024639 00000 п. 0000024875 00000 п. 0000025002 00000 п. 0000025129 00000 п. 0000025287 00000 п. 0000025432 00000 п. 0000025559 00000 п. 0000025717 00000 п. 0000025866 00000 п. 0000026024 00000 п. 0000026158 00000 п. 0000026285 00000 п. 0000026522 00000 п. 0000026680 00000 п. 0000026841 00000 п. 0000026976 00000 п. 0000027145 00000 п. 0000027382 00000 п. 0000027619 00000 н. 0000027856 00000 п. 0000028013 00000 п. 0000028207 00000 п. 0000028365 00000 п. 0000028513 00000 п. 0000028671 00000 п. 0000028814 00000 п. 0000028962 00000 п. 0000029120 00000 н. 0000029357 00000 п. 0000029540 00000 п. 0000029667 00000 п. 0000029825 00000 п. 0000030017 00000 п. 0000030175 00000 п. 0000030392 00000 п. 0000030549 00000 п. 0000030707 00000 п. 0000030841 00000 п. 0000030968 00000 п. 0000031126 00000 п. 0000031304 00000 п. 0000031541 00000 п. 0000031699 00000 н. 0000031872 00000 п. 0000032030 00000 п. 0000032213 00000 п. 0000032371 00000 п. 0000032522 00000 н. 0000032681 00000 п. 0000032808 00000 п. 0000032977 00000 п. 0000033171 00000 п. 0000033340 00000 п. 0000033494 00000 п. 0000033621 00000 п. 0000033779 00000 п. 0000033977 00000 п. 0000034135 00000 п. 0000034340 00000 п. 0000034577 00000 п. 0000034734 00000 п. 0000034892 00000 п. 0000035056 00000 п. 0000035293 00000 п. 0000035450 00000 п. 0000035610 00000 п. 0000035833 00000 п. 0000035982 00000 п. 0000036216 00000 п. 0000036353 00000 п. 0000036586 00000 п. 0000036747 00000 п. 0000036871 00000 п. 0000037104 00000 п. 0000037336 00000 п. 0000037568 00000 п. 0000037687 00000 п. 0000037921 00000 п. 0000038154 00000 п. 0000038315 00000 п. 0000038460 00000 п. 0000038694 00000 п. 0000038927 00000 п. 0000039065 00000 п. 0000039430 00000 п. 0000039663 00000 п. 0000039895 00000 п. 0000040032 00000 н. 0000040165 00000 п. 0000040398 00000 п. 0000040558 00000 п. 0000040721 00000 п. 0000040955 00000 п. 0000041092 00000 п. 0000041325 00000 п. 0000041486 00000 п. 0000041719 00000 п. 0000041851 00000 п. 0000042085 00000 п. 0000042318 00000 п. 0000042479 00000 п. 0000042628 00000 п. 0000042740 00000 п. 0000042906 00000 п. 0000043043 00000 п. 0000043186 00000 п. 0000043344 00000 п. 0000043501 00000 п. 0000043732 00000 п. 0000043909 00000 п. 0000044034 00000 п. 0000044196 00000 п. 0000044349 00000 п. 0000004156 00000 н. трейлер ] / Назад 2527226 >> startxref 0 %% EOF 1278 0 объект > поток hZ {PT?, ry ݽ, ++ «> 1 D; (Q1) *: RBbL4fF1c & 6> h «$: TMjkY: p

Normatív SNP, SanPin

Egészségügyi szabályok és normák (SanPiN) — ez rendeletek olyan járványügyi szabályok és normák, amelyek széles skáláját ölelik fel a területén az emberi temberi.

Itt a leírás a fent említett dokumentumok, valamint megadja a lehetőséget, hogy letölt egy ingyenes nyissz.

Vízellátás. Külső hálózatok és létesítmények

nyissz 2.04.02-84
Ható. szennyvíztisztító rendszerek projekteket hozzanak létre együtt vízellátási projektek. Ezért cégünk, valamint a telepítés mély biológiai kezelést végző végző munka javítására kutak víz a házba, hogy a végfelhasználó.

Csatornázás. Külső hálózatok és létesítmények

ниссз 2.04.03-85
Úgy működik, részben. A fő szabályozó dokumentum telepítésekor állomások mély biológiai kezelés SNP 2.04.03-85 «Vízelvezető. Külső hálózatok és létesítmények «. Szabályok és előírások meghatározott е dokumentumban быть Келл tartani tervezés újonnan épített és korszerűsített rendszerek külső csatornázás Allando időpontot települések, illetve аз Egyedi épületek. Ezen kívül kijelzi értékek szennyvíztisztítás teljesítmény Utan KOI és BOI, és аз értékek аз alapvető paraméterek ilyen vegyszerek — мята foszfor-vegyületek, ammónium-sók, kloridok, felületaktív anyagok.Mindezek a követelmények teljes mértékben összhangban vannak az állomáson mély biológiai kezelés YUNILOS Astra.

Belső vízellátás és csatornázás épületek

nyissz 2.04.01-85
Ható. «SlavAkva» А cég szakemberei szabályokat és előírásokat nyissz 2.04.01-85 «Belső vízellátás és csatornázás épületek», дизайн hideg és Мелег ЗВП, A helyiségek fűtésére és háztartási szennyvíz, A helyes telepítés аз ilyen rendszerek nagyon és szükséges Важная аз egyes vidéki ház. Иез szabályok lehetővé teszik, hogy szervezze мег és építsenek EGY gázvezeték hideg és Мелег ВИЗ bejutását házba, hogy szennyvízcsatornába és eszközöket vízvezeték összteljesítményéhez ЗТВ és szennyvíztisztító Telep, мята például в «YUNILOS Astra».Követelményeknek való megfelelést a nyissz anyagokon is a folyamatban lévő munka biztosítja megbízhatóság is a tartósság rendszer, valamint a zavartalan mködését. Szakembereink ilyen munkát végez «kulcsrakész», a közbeszerzési anyagokat a válogatott szivattyúberendezések, szűrők, további tartályok, konténerek és mézénésiegézénésiezézüksi.

Higiéniai követelmények a felszíni vizek védelme

СанПиН2.1.5.980-00
Хато.Fő dokumentum, Amely igazolja biztonsági és ökológiai állomások Mely biológiai kezelés «YUNILOS Астра» EGY megfelelőségi tanúsítványt EGY студень törvények betartását és előírásokat СанПиН 2.1.5.980-00 «higiéniai követelmények Felszíni vizek védelme», amelyek segítségével határozza мег, hogy аз elrablás szennyvíz-állomások keresztül mély biológiai kezelés «YUNILOS Astra» található területekre közeli folyók, tavak és egyéb víztestek, kivéve a szennyeződ. Állomások «YUNILOS Astra» олян тисзтито тавозо фолядек 98%, és lehetővé teszi, hogy a mentesítés a kezelt szennyvíz közvetlenül a földbe, és a felszíbeözání kízény nem.

Zónák egészségügyi védelmét a vízforrások és az ivóvizet csővezetékek

Egészségügyi-járványügyi szabályok és normák

СанПиН 2.2.1 / 2.1.1.1200-03
Хато. СанПиН 2.2.1 / 2.1.1.1200-03 «egészségügyi-járványügyi szabályok és Normak» rendelkezéseket tartalmaz ártalmatlanítására IPARI termelési létesítmények lakóterületek, rekreációs területek, lakossági fejlesztések és meghatározza Meret egészségügyi védelmi zónák аз ilyen tárgyakat. A követelmények ezen szabályokat alkalmaznak a tervezés és elhelyezése аз újonnan épített és a meglévő ipari létesítmények.Иез аз egészségügyi szabályoknak veszélyességi osztályba IPARI létesítmények és üzemek, attól függően, hogy fajta tevékenység, Amely lehetővé teszi, hogy pontosan meghatározza аз egészségügyi védelmi zónák elkerülése érdekében közegészséget veszélyeztető fenyegetések. Meghatározásának kritériuma a zóna a szennyező anyagok koncentrációjának a légkörbe kerül eredményeként a termelés és ipari létesítmények.

Tanácsra van szüksége?

Kapcsolódó cikkek

Окинава | Yakuza Wiki | Фэндом

Окинавская

Якудза 3 []

Окинавая — единственное место, где Кирю может покупать продукты, чтобы восстановить свое здоровье во время предстоящей битвы с боссом Рикия Симабукуро.

шт. []

Якудза 3 []

Обратите внимание, что названия и описания предметов взяты из обновленной версии Yakuza 3 . Они могут отличаться от оригинала.

Галерея []

% PDF-1.4 % 1151 0 объект > эндобдж xref 1151 837 0000000016 00000 н. 0000019827 00000 п. 0000020044 00000 п. 0000020090 00000 н. 0000020127 00000 н. 0000030678 00000 п. 0000030895 00000 п. 0000031043 00000 п. 0000031218 00000 п. 0000031369 00000 п. 0000031513 00000 п. 0000031662 00000 п. 0000031799 00000 п. 0000031949 00000 п. 0000032086 00000 п. 0000032234 00000 п. 0000032370 00000 п. 0000032518 00000 п. 0000032657 00000 п. 0000032805 00000 п. 0000032945 00000 п. 0000033093 00000 п. 0000033231 00000 п. 0000033379 00000 п. 0000033516 00000 п. 0000033666 00000 п. 0000033802 00000 п. 0000033950 00000 п. 0000034088 00000 п. 0000034236 00000 п. 0000034374 00000 п. 0000034522 00000 п. 0000034660 00000 п. 0000034808 00000 п. 0000034946 00000 п. 0000035094 00000 п. 0000035231 00000 п. 0000035379 00000 п. 0000035517 00000 п. 0000035665 00000 п. 0000035802 00000 п. 0000035952 00000 п. 0000036090 00000 п. 0000036238 00000 п. 0000036376 00000 п. 0000036524 00000 п. 0000036661 00000 п. 0000036808 00000 п. 0000036947 00000 п. 0000037095 00000 п. 0000037233 00000 п. 0000037381 00000 п. 0000037519 00000 п. 0000037667 00000 п. 0000037805 00000 п. 0000037953 00000 п. 0000038091 00000 п. 0000038239 00000 п. 0000038376 00000 п. 0000038524 00000 п. 0000038660 00000 п. 0000038808 00000 п. 0000038944 00000 п. 0000039092 00000 н. 0000039228 00000 п. 0000039376 00000 п. 0000039545 00000 п. 0000039693 00000 п. 0000039797 00000 п. 0000039836 00000 п. 0000051214 00000 п. 0000060391 00000 п. 0000068198 00000 п. 0000075110 00000 п. 0000082149 00000 п. 0000088847 00000 п. 0000089039 00000 н. 0000089471 00000 п. 0000089869 00000 п. 00000 ^{00000 п. 00000}

00000 н. 00001

00000 н. 0000191072 00000 н. 0000191228 00000 н. 0000191384 00000 н. 0000191540 00000 н. 0000191696 00000 н. 0000191852 00000 н. 0000192007 00000 н. 0000192163 00000 н. 0000192319 00000 н. 0000192473 00000 н. 0000192629 00000 н. 0000192784 00000 н. 0000192940 00000 н. 0000193095 00000 н. 0000193251 00000 н. 0000193407 00000 н. 0000193562 00000 н. 0000193717 00000 н. 0000193873 00000 н. 0000194028 00000 н. 0000194183 00000 н. 0000194339 00000 н. 0000194496 00000 н. 0000194652 00000 н. 0000194809 00000 н. 0000194967 00000 н. 0000195123 00000 н. 0000195280 00000 н. 0000195438 00000 н. 0000196036 00000 н. 0000196193 00000 н. 0000196349 00000 п. 0000196927 00000 н. 0000197083 00000 н. 0000197670 00000 н. 0000197827 00000 н. 0000198394 00000 н. 0000198551 00000 н. 0000198709 00000 н. 0000198866 00000 н. 0000199021 00000 н. 0000199178 00000 н. 0000199335 00000 н. 0000199492 00000 н. 0000199648 00000 н. 0000199804 00000 н. 0000199961 00000 н. 0000200117 00000 н. 0000200272 00000 н. 0000200429 00000 н. 0000200584 00000 н. 0000200739 00000 н. 0000200896 00000 н. 0000201053 00000 н. 0000201209 00000 н. 0000201366 00000 н. 0000201522 00000 н. 0000201679 00000 н. 0000201836 00000 н. 0000201992 00000 н. 0000202148 00000 н. 0000202305 00000 н. 0000202462 00000 н. 0000202618 00000 н. 0000202775 00000 н. 0000202932 00000 н. 0000203089 00000 н. 0000203245 00000 н. 0000203401 00000 н. 0000203557 00000 н. 0000203714 00000 н. 0000203871 00000 н. 0000204027 00000 н. 0000204182 00000 н. 0000204338 00000 н. 0000204494 00000 н. 0000204651 00000 н. 0000204808 00000 н. 0000204964 00000 н. 0000205121 00000 н. 0000205277 00000 н. 0000205433 00000 н. 0000205590 00000 н. 0000205746 00000 н. 0000205903 00000 н. 0000206060 00000 н. 0000206217 00000 н. 0000206374 00000 н. 0000206531 00000 н. 0000207151 00000 н. 0000207308 00000 н. 0000207464 00000 н. 0000207621 00000 н. 0000207778 00000 н. 0000207935 00000 п. 0000208092 00000 н. 0000208247 00000 н. 0000208403 00000 н. 0000208560 00000 н. 0000208717 00000 н. 0000208874 00000 н. 0000209031 00000 н. 0000209187 00000 н. 0000209344 00000 н. 0000209501 00000 н. 0000209656 00000 н. 0000209813 00000 н. 0000209970 00000 н. 0000210127 00000 н. 0000210284 00000 п. 0000210441 00000 п. 0000210598 00000 н. 0000210755 00000 н. 0000210911 00000 п. 0000211067 00000 н. 0000211224 00000 н. 0000211381 00000 п. 0000211538 00000 п. 0000211694 00000 п. 0000211851 00000 п. 0000212008 00000 н. 0000212165 00000 н. 0000212322 00000 н. 0000212479 00000 н. 0000212635 00000 н. 0000212792 00000 н. 0000213377 00000 н. 0000213532 00000 н. 0000214102 00000 п. 0000214257 00000 н. 0000214828 00000 н. 0000214983 00000 п. 0000215138 00000 н. 0000215701 00000 н. 0000215856 00000 н. 0000216010 00000 н. 0000216165 00000 н. 0000216320 00000 н. 0000216475 00000 н. 0000216631 00000 н. 0000216786 00000 н. 0000216939 00000 н. 0000217093 00000 н. 0000217247 00000 н. 0000217401 00000 н. 0000217556 00000 н. 0000217711 00000 н. 0000217866 00000 н. 0000218020 00000 н. 0000218175 00000 н. 0000218331 00000 п. 0000218485 00000 н. 0000218640 00000 н. 0000218794 00000 п. 0000218948 00000 н. 0000219103 00000 п. 0000219257 00000 н. 0000219412 00000 н. 0000219566 00000 н. 0000219720 00000 н. 0000219875 00000 н. 0000220031 00000 н. 0000220186 00000 н. 0000220341 00000 п. 0000220496 00000 н. 0000220651 00000 н. 0000220805 00000 н. 0000220960 00000 н. 0000221115 00000 н. 0000221270 00000 н. 0000221425 00000 н. 0000221580 00000 н. 0000221736 00000 н. 0000221891 00000 н. 0000222045 00000 н. 0000222200 00000 н. 0000222355 00000 н. 0000222510 00000 н. 0000222665 00000 н. 0000222820 00000 н. 0000222975 00000 н. 0000223130 00000 н. 0000223283 00000 н. 0000223439 00000 н. 0000223594 00000 н. 0000223748 00000 н. 0000223902 00000 н. 0000224057 00000 н. 0000224212 00000 н. 0000224367 00000 н. 0000224522 00000 н. 0000224677 00000 н. 0000224832 00000 н. 0000224985 00000 п. 0000225140 00000 н. 0000225295 00000 н. 0000225449 00000 н. 0000225604 00000 н. 0000225759 00000 н. 0000225914 00000 н. 0000226069 00000 н. 0000226224 00000 н. 0000226378 00000 п. 0000226533 00000 н. 0000226687 00000 н. 0000226843 00000 н. 0000226999 00000 н. 0000227154 00000 н. 0000227308 00000 н. 0000227463 00000 н. 0000227618 00000 н. 0000227773 00000 н. 0000227928 00000 н. 0000228083 00000 н. 0000228237 00000 н. 0000228391 00000 н. 0000228546 00000 н. 0000228702 00000 н. 0000228857 00000 н. 0000229012 00000 н. 0000229558 00000 н. 0000229715 00000 н. 0000230250 00000 н. 0000230406 00000 н. 0000230949 00000 н. 0000231106 00000 н. 0000231635 00000 н. 0000231792 00000 н. 0000231950 00000 н. 0000232486 00000 н. 0000232643 00000 н. 0000233161 00000 п. 0000233316 00000 н. 0000233835 00000 н. 0000233991 00000 н. 0000234147 00000 п. 0000234668 00000 н. 0000234825 00000 н. 0000234983 00000 п. 0000235140 00000 н. 0000235296 00000 п. 0000235453 00000 п. 0000235610 00000 н. 0000235767 00000 н. 0000235924 00000 н. 0000236081 00000 н. 0000236238 00000 п. 0000236394 00000 н. 0000236551 00000 н. 0000236708 00000 н. 0000236865 00000 н. 0000237021 00000 н. 0000237178 00000 н. 0000237334 00000 п. 0000237490 00000 н. 0000237647 00000 н. 0000237803 00000 н. 0000237959 00000 н. 0000238115 00000 н. 0000238270 00000 н. 0000238426 00000 н. 0000238583 00000 н. 0000238740 00000 н. 0000238897 00000 н. 0000239054 00000 н. 0000239211 00000 н. 0000239368 00000 н. 0000239524 00000 н. 0000239681 00000 н. 0000239837 00000 п. 0000239994 00000 н. 0000240151 00000 п. 0000240308 00000 п. 0000240465 00000 н. 0000240621 00000 н. 0000240778 00000 п. 0000240933 00000 п. 0000241090 00000 н. 0000241246 00000 н. 0000241403 00000 н. 0000241559 00000 н. 0000241716 00000 н. 0000241871 00000 н. 0000242027 00000 н. 0000242184 00000 н. 0000242339 00000 н. 0000242496 00000 н. 0000242653 00000 н. 0000242810 00000 н. 0000242967 00000 н. 0000243123 00000 н. 0000243278 00000 н. 0000243435 00000 н. 0000243592 00000 н. 0000243747 00000 н. 0000243902 00000 н. 0000244058 00000 н. 0000244214 00000 н. 0000244371 00000 н. 0000244527 00000 н. 0000244682 00000 н. 0000244837 00000 н. 0000244993 00000 н. 0000245149 00000 н. 0000245306 00000 н. 0000245462 00000 н. 0000245617 00000 н. 0000245773 00000 н. 0000245929 00000 н. 0000246086 00000 н. 0000246242 00000 н. 0000246398 00000 н. 0000246554 00000 н. 0000246709 00000 н. 0000246865 00000 н. 0000247022 00000 н. 0000247178 00000 н. 0000247335 00000 п. 0000247492 00000 н. 0000247649 00000 н. 0000247806 00000 н. 0000247963 00000 н. 0000248120 00000 н. 0000248277 00000 н. 0000248433 00000 н. 0000248587 00000 н. 0000248744 00000 н. 0000248901 00000 н. 0000249056 00000 н. 0000249212 00000 н. 0000249369 00000 н. 0000249526 00000 н. 0000249683 00000 н. 0000249839 00000 н. 0000249996 00000 н. 0000250153 00000 н. 0000250309 00000 н. 0000250466 00000 н. 0000250623 00000 п. 0000250779 00000 н. 0000250935 00000 п. 0000251092 00000 н. 0000251247 00000 н. 0000251403 00000 н. 0000251560 00000 н. 0000251717 00000 н. 0000251874 00000 н. 0000252030 00000 н. 0000252186 00000 н. 0000252340 00000 н. 0000252497 00000 н. 0000252654 00000 н. 0000252811 00000 н. 0000252967 00000 н. 0000253124 00000 н. 0000253281 00000 н. 0000253437 00000 н. 0000253594 00000 н. 0000253750 00000 н. 0000253906 00000 н. 0000254063 00000 н. 0000254217 00000 н. 0000254374 00000 н. 0000254531 00000 н. 0000254688 00000 н. 0000254841 00000 н. 0000254996 00000 н. 0000255152 00000 н. 0000255308 00000 н. 0000255464 00000 н. 0000255621 00000 н. 0000255778 00000 н. 0000255934 00000 н. 0000256091 00000 н. 0000256247 00000 н. 0000256404 00000 н. 0000256561 00000 н. 0000256718 00000 н. 0000256875 00000 н. 0000257032 00000 н. 0000257187 00000 н. 0000257344 00000 н. 0000257501 00000 н. 0000257658 00000 н. 0000257815 00000 н. 0000257972 00000 н. 0000258128 00000 н. 0000258284 00000 н. 0000258440 00000 н. 0000258597 00000 н. 0000258754 00000 н. 0000258910 00000 н. 0000259066 00000 н. 0000259223 00000 н. 0000259380 00000 н. 0000259535 00000 н. 0000259692 00000 н. 0000259848 00000 н. 0000260004 00000 н. 0000260161 00000 п. 0000260318 00000 п. 0000260475 00000 н. 0000260631 00000 н. 0000260788 00000 н. 0000260942 00000 н. 0000261096 00000 н. 0000261251 00000 н. 0000261406 00000 н. 0000261562 00000 н. 0000262092 00000 н. 0000262247 00000 н. 0000262768 00000 н. 0000262921 00000 н. 0000263447 00000 н. 0000263601 00000 н. 0000264119 00000 н. 0000264273 00000 н. 0000264429 00000 н. 0000264585 00000 н. 0000264740 00000 н. 0000264893 00000 н. 0000265048 00000 н. 0000265203 00000 н. 0000265358 00000 н. 0000265513 00000 н. 0000265668 00000 н. 0000265823 00000 п. 0000265978 00000 н. 0000266134 00000 н. 0000266289 00000 н. 0000266444 00000 н. 0000266599 00000 н. 0000266754 00000 н. 0000266909 00000 н. 0000267063 00000 н. 0000267217 00000 н. 0000267372 00000 н. 0000267527 00000 н. 0000267682 00000 н. 0000267838 00000 н. 0000267994 00000 н. 0000268148 00000 н. 0000268303 00000 п. 0000268458 00000 п. 0000268613 00000 н. 0000268768 00000 н. 0000268922 00000 н. 0000269077 00000 н. 0000269231 00000 п. 0000269386 00000 н. 0000269540 00000 н. 0000269696 00000 н. 0000269849 00000 н. 0000270003 00000 н. 0000270158 00000 н. 0000270312 00000 п. 0000270467 00000 н. 0000270620 00000 н. 0000270775 00000 н. 0000270930 00000 н. 0000271084 00000 н. 0000271239 00000 н. 0000271395 00000 н. 0000271548 00000 н. 0000271703 00000 н. 0000271858 00000 н. 0000272012 00000 н. 0000272167 00000 н. 0000272322 00000 н. 0000272477 00000 н. 0000272632 00000 н. 0000272786 00000 н. 0000272941 00000 н. 0000273097 00000 н. 0000273252 00000 н. 0000273404 00000 н. 0000273558 00000 н. 0000273712 00000 н. 0000273866 00000 н. 0000274021 00000 н. 0000274176 00000 н. 0000274330 00000 н. 0000274484 00000 н. 0000274639 00000 н. 0000274794 00000 н. 0000274949 00000 н. 0000275104 00000 п. 0000275259 00000 н. 0000275414 00000 н. 0000275568 00000 н. 0000275723 00000 н. 0000275877 00000 н. 0000276032 00000 н. 0000276186 00000 н. 0000276340 00000 н. 0000276496 00000 н. 0000276651 00000 н. 0000276805 00000 н. 0000276960 00000 н. 0000277114 00000 н. 0000277269 00000 н. 0000277424 00000 н. 0000277579 00000 н. 0000277734 00000 н. 0000277889 00000 н. 0000278044 00000 н. 0000278200 00000 н. 0000278355 00000 н. 0000278509 00000 н. 0000278664 00000 н. 0000278819 00000 н. 0000278974 00000 н. 0000279129 00000 н. 0000279282 00000 н. 0000279437 00000 н. 0000279590 00000 н. 0000279745 00000 н. 0000279900 00000 н. 0000280055 00000 н. 0000280209 00000 н. 0000280363 00000 п. 0000280518 00000 п. 0000280671 00000 н. 0000280825 00000 н. 0000280979 00000 н. 0000281134 00000 н. 0000281289 00000 н. 0000281443 00000 н. 0000281599 00000 н. 0000281752 00000 н. 0000281907 00000 н. 0000282061 00000 н. 0000282215 00000 н. 0000282369 00000 н. 0000282524 00000 н. 0000282679 00000 н. 0000282834 00000 н. 0000282989 00000 н. 0000283144 00000 н. 0000283300 00000 н. 0000283455 00000 н. 0000283607 00000 н. 0000283762 00000 н. 0000283917 00000 н. 0000284072 00000 н. 0000284226 00000 п. 0000284381 00000 п. 0000284535 00000 н. 0000284690 00000 н. 0000284845 00000 н. 0000285000 00000 н. 0000285156 00000 н. 0000285311 00000 п. 0000285464 00000 н. 0000285618 00000 п. 0000285771 00000 п. 0000285926 00000 н. 0000286081 00000 н. 0000286236 00000 п. 0000286390 00000 н. 0000286545 00000 н. 0000286700 00000 н. 0000286856 00000 н. 0000287010 00000 п. 0000287165 00000 н. 0000287320 00000 н. 0000287475 00000 п. 0000287630 00000 н. 0000287785 00000 н. 0000287939 00000 п. 0000288094 00000 н. 0000288249 00000 н. 0000288403 00000 н. 0000288559 00000 н. 0000288714 00000 н. 0000288869 00000 н. 0000289023 00000 н. 0000289178 00000 н. 0000289333 00000 п. 0000289488 00000 н. 0000289643 00000 н. 0000289797 00000 н. 0000289952 00000 н. 00002 00000 н. 00002 00000 н. 00002 00000 н. 00002 00000 н. 00002 00000 н. 00002

00000 н. 0000291044 00000 н. 0000291198 00000 н. 0000291354 00000 н. 0000291510 00000 н. 0000291665 00000 н. 0000291821 00000 н. 0000291977 00000 н. 0000292133 00000 н. 0000292288 00000 н. 0000292442 00000 н. 0000292598 00000 н. 0000292754 00000 н. 0000292910 00000 н. 0000293066 00000 н. 0000293222 00000 н. 0000293378 00000 н. 0000293533 00000 н. 0000293688 00000 н. 0000293842 00000 н. 0000293998 00000 н. 0000294153 00000 н. 0000294309 00000 н. 0000294465 00000 н. 0000294621 00000 н. 0000294777 00000 н. 0000294932 00000 н. 0000295087 00000 н. 0000295241 00000 н. 0000295397 00000 н. 0000295553 00000 н. 0000295709 00000 н. 0000295864 00000 н. 0000296020 00000 н. 0000296176 00000 н. 0000296620 00000 н. 0000296671 00000 н. 0000299718 00000 н. 0000300062 00000 н. 0000300112 00000 н. 0000300504 00000 н. 0000300699 00000 н. 0000300918 00000 п. 0000301128 00000 н. 0000301323 00000 н. 0000301533 00000 н. 0000301752 00000 н. 0000301947 00000 н. 0000302157 00000 н. 0000302367 00000 н. 0000302568 00000 н. 0000302821 00000 н. 0000302871 00000 н. 0000303175 00000 н. 0000303385 00000 н. 0000303595 00000 н. 0000303796 00000 н. 0000314467 00000 н. 0000315407 00000 н. 0000316010 00000 н. 0000316061 00000 н. 0000316610 00000 н. 0000317918 00000 н. 0000318610 00000 н. 0000318661 00000 н. 0000319176 00000 н. 0000319348 00000 н. 0000319398 00000 н. 0000319631 00000 н. 0000320287 00000 н. 0000320497 00000 н. 0000320572 00000 н. 0000320889 00000 н. Published by alexxlab View all posts by alexxlab Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт