Тальк трпв гост 19729 74: Тальк марки ТРПН ГОСТ 19729-74

ГОСТ 19729-74 — Тальк молотый для производства резиновых изделий и пластических масс. Технические условия

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ТАЛЬК МОЛОТЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА
РЕЗИНОВЫХ ИЗДЕЛИЙ
И ПЛАСТИЧЕСКИХ МАСС

ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ

ГОСТ 19729-74

КОМИТЕТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И МЕТРОЛОГИИ СССР

Москва

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ТАЛЬК МОЛОТЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА РЕЗИНОВЫХ ИЗДЕЛИЙ И ПЛАСТИЧЕСКИХ МАСС Технические условия Ground talc for manufacture of rubber products and plastics. Specifications

ГОСТ 19729-74

Срок действия с 01.01.76

до 01.01.96

Настоящий стандарт распространяется на молотый тальк, предназначенный для применения в качестве наполнителя и для вспомогательных целей в резиновой промышленности и промышленности пластических масс.

1. МАРКИ

1.1. В зависимости от физико-химического состава молотый тальк поставляют следующих марок:

ТРПН — для наполнения резин и пластических масс;

ТРПВ — для вспомогательных целей (опудривания и присыпки).

2. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ

2.1. Молотый тальк по физико-химическим показателям должен соответствовать нормам, указанным в таблице.

Наименование показателя	Норма для марок		Метод испытания
	ТРПН	ТРПВ
Прокаленный нерастворимый в соляной кислоте остаток, %, не менее	90	87	По ГОСТ 19728.1-74
Массовая доля окиси железа в солянокислой вытяжке, %, не более	0,9	1,2	По ГОСТ 19728.4-88
Массовая доля железа, извлекаемая магнитом, %, не более	0,04	0,08	По технической документации, утвержденной в установленном порядке
Потеря массы при прокаливании, %, не более	7	8	По ГОСТ 19728.17-74
Массовая доля влаги, %, не более	0,5	1	По ГОСТ 19728.19-74
Остаток на сетке, %, не более:
№ 014	Отсутствие		По ГОСТ 19728.20-74
№ 009	2	—

(Измененная редакция, Изм. № 2).

2.2. В молотом тальке всех марок не допускается наличие посторонних примесей, видимых невооруженным глазом.

2а. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ

2а.1. Тальк — вещество нетоксичное, 4-го класса опасности (вещества малоопасные).

2а.2. Тальковая пыль оказывает вредное воздействие на органы дыхания.

2а.3. Предельно допустимая концентрация тальковых аэрозолей в воздухе рабочей зоны — 4 мг/м³.

2а.4. Для защиты органов дыхания от тальковых аэрозолей применяют респираторы различных типов.

Разд. 2а. (Введен дополнительно, Изм. № 1).

3. ПРАВИЛА ПРИЕМКИ

3.1. Молотый тальк принимают партиями. Партией считают количество молотого талька одной марки, оформленное одним документом о качестве, в котором должны быть указаны:

наименование предприятия-изготовителя;

наименование и марка продукции;

номер и дата выдачи документа;

масса партии нетто;

номер партии;

номер вагона или контейнера;

дата отгрузки;

результаты испытаний;

обозначение настоящего стандарта.

Массу партии определяют по согласованию изготовителя с потребителем.

3.2. Для проверки соответствия качества партии молотого талька, упакованного в мешки, требованиям настоящего стандарта отбирают методом случайного отбора каждый 100-й мешок, но не менее 10 мешков от партии.

От партии талька, упакованного в контейнеры, отбирают каждый контейнер.

Масса объединенной пробы должна быть не менее 3 кг.

3.1; 3.2. (Измененная редакция, Изм. № 1).

3.3. При несоответствии результатов испытаний требованиям настоящего стандарта хотя бы по одному из показателей проводят повторное испытание по этим показателям на удвоенной выборке, отобранной от той же партии.

Результаты повторных испытаний являются окончательными и распространяются на всю партию.

4. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ

4.1. Отбор и подготовка проб для испытаний — по ГОСТ 19730-74.

Молотый тальк, транспортируемый контейнерами, отбирают щупом на всю глубину слоя из десяти разных точек. Масса точечной пробы должна быть не менее 0,3 кг.

(Измененная редакция, Изм. № 1).

4.2. Методы испытаний указаны в п. 2.1.

5. МАРКИРОВКА, УПАКОВКА, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ

5.1. На каждом контейнере или мешке должны быть обозначены:

наименование предприятия-изготовителя;

наименование и марка продукции;

номер партии;

масса нетто;

дата изготовления;

обозначение настоящего стандарта.

5.2. Транспортная маркировка — по ГОСТ 14192-77.

5.3. Молотый тальк упаковывают в бумажные мешки по ГОСТ 2226-88 всех марок с числом слоев не менее четырех. Масса нетто молотого талька в мешке должна быть не более 35 кг. По согласованию изготовителя с потребителем допускается упаковывать молотый тальк в специализированные контейнеры для сыпучих грузов, изготовленные по нормативно-технической документации, утвержденной в установленном порядке.

5.4. Молотый тальк транспортируют транспортом всех видов в крытых транспортных средствах.

По согласованию изготовителя с потребителем молотый тальк, упакованный в специализированные контейнеры, транспортируют на открытых транспортных средствах повагонными отправками в прямом железнодорожном сообщении.

Транспортирование производят в соответствии с правилами перевозки, действующими на транспорте данных видов.

5.3, 5.4. (Измененная редакция, Изм. № 2).

6. ГАРАНТИИ ИЗГОТОВИТЕЛЯ

6.1. Изготовитель гарантирует соответствие молотого талька требованиям настоящего стандарта при соблюдении условий хранения.

6.2. Гарантийный срок хранения молотого талька — 1 год со дня изготовления.

Разд. 5, 6. (Измененная редакция, Изм. № 1).

Разд. 7. (Исключен, Изм. № 1).

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством промышленности строительных материалов СССР

РАЗРАБОТЧИКИ

И.В. Суравенков (руководитель темы), Т.П. Чубкова, Т.А. Пронина, Л.Б. Бурматнова

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 25.04.74 № 988

3. Срок первой проверки- 1980 г.

Периодичность проверки — 5 лет

4. ВЗАМЕН ГОСТ 879-52

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

6. Срок действия продлен до 01.01.96 Постановлением Госстандарта СССР от 27.09.90 № 2578

7. Переиздание (январь 1992 г.) с Изменениями № 1, 2, утвержденными в декабре 1984 г., сентябре 1990 г. (ИУС 3-85, 12-90).

СОДЕРЖАНИЕ

1. МАРКИ 1 2. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ 1 2а. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ 2 3. ПРАВИЛА ПРИЕМКИ 2 4. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ 2 5. МАРКИРОВКА, УПАКОВКА, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ 3 6. ГАРАНТИИ ИЗГОТОВИТЕЛЯ 3

Тендеры на тальк | Все тендеры России

Тендеры по категориям

Тендер № 54705843  от 02.09.21 Окончание 14.09.2021 в 10:00 (МСК)

Начальная цена

—

Тендер № 54090539  от 03.08.21 Окончание 11.08.2021 в 09:00 (МСК)

Начальная цена

2 150‍ ₽ 

Тендер № 53888641  от 23.07.21 Окончание 26.07.2021 в 09:00 (МСК)

Начальная цена

—

Тендер № 53685839  от 13.07.21 Окончание 16.07.2021

Начальная цена

—

Тендер № 53602279  от 08.07.21 Окончание 09.07.2021 в 12:00 (МСК)

Начальная цена

1‍ ₽ 

Тендер № 53572213  от 07.07.21 Окончание 09.07.2021

Начальная цена

—

Тендер № 53385879  от 28.06.21 Окончание 01.07.2021

г. Нижний Новгород

Начальная цена

—

Тендер № 53382954  от 28.06.21 Окончание 01.07.2021

г. Нижний Новгород

Начальная цена

—

Тендер № 53380091  от 28.06.21 Окончание 02.07.2021

г. Екатеринбург

Начальная цена

—

Тендер № 53168577  от 17.06.21 Окончание 30.06.2021

Начальная цена

—

Тендер № 52969251  от 07.06.21 Окончание 17.06.2021

Начальная цена

—

Тендер № 52774179  от 28.05.21 Окончание 02.06.2021

Начальная цена

—

Тендер № 52465607  от 17.05.21 Окончание 27.05.2021

Начальная цена

—

Тендер № 52440288  от 14.05.21 Окончание 21.05.2021

г. Набережные Челны

Начальная цена

—

Тендер № 52435347  от 14.05.21 Окончание 18.05.2021

Начальная цена

2 790‍ ₽ 

Тендер № 52407721  от 13.05.21 Окончание 17.05.2021

Начальная цена

—

Тендер № 52346300  от 11.05.21 Окончание 13.05.2021

Начальная цена

—

Тендер № 52285381  от 04.05.21

Изм.Изменён 07.05.2021

Окончание 11.05.2021

Начальная цена

—

Тендер № 52280905  от 04.05.21 Окончание 19.05.2021

Начальная цена

60 600‍ ₽ 

Тендер № 52133453  от 26.04.21 Окончание 29.04.2021

Начальная цена

—

Тендер № 52089463  от 23.04.21

Изм.Изменён 28.04.2021

Окончание 29.04.2021

г. Стерлитамак

Начальная цена

—

Тендер № 51751494  от 08.04.21 Окончание 14.04.2021

Начальная цена

—

Тендер № 51430176  от 26.03.21 Окончание 30.03.2021

Начальная цена

—

Тендер № 51304774  от 22.03.21 Окончание 22.03.2021

г.Старый Оскол

Начальная цена

7 920‍ ₽ 

Тендер № 51115956  от 13.03.21

Изм.Изменён 23.03.2021

Окончание 22.03.2021

Начальная цена

83 660‍ ₽ 

Тендер № 50983445  от 05.03.21 Окончание 12.03.2021

г. Кирово-Чепецк

Начальная цена

—

Тендер № 50976600  от 05.03.21 Окончание 12.03.2021

Начальная цена

6 000‍ ₽ 

Тендер № 50767498  от 25.02.21 Окончание 25.02.2021

Начальная цена

15 650‍ ₽ 

Тендер № 50762592  от 24.02.21

Изм.Изменён 01.03.2021

Окончание 01.03.2021

Начальная цена

—

Тендер № 50584011  от 16.02.21 Окончание 02.03.2021

Начальная цена

—

Тендер № 50501828  от 11.02.21

Изм.Изменён 18.02.2021

Окончание 18.02.2021

Начальная цена

—

Тендер № 50465610  от 10.02.21 Окончание 17.02.2021

Начальная цена

—

Тендер № 50425208  от 09.02.21

Изм.Изменён 12.02.2021

Окончание 12.02.2021

Начальная цена

—

Тендер № 50113369  от 07.02.21 Окончание 29.01.2021

Начальная цена

—

Тендер № 50254555  от 01.02.21 Окончание 01.02.2021

Начальная цена

3 500‍ ₽ 

Тендер № 50238159  от 29.01.21 Окончание 02.02.2021

Луганская Народная Республика

Начальная цена

—

Тендер № 50189389  от 28.01.21

Изм.Изменён 08.02.2021

Окончание 05.02.2021

Начальная цена

5 440‍ ₽ 

Обеспечение контракта: 544‍ ₽ 

Обеспечение заявки: 54‍ ₽ 

Тендер № 50151865  от 26.01.21 Окончание 28.01.2021

село Нижнедевицк

Начальная цена

—

Тендер № 50116179  от 25.01.21 Окончание 28.01.2021

г. Стерлитамак

Начальная цена

—

Тендер № 50114076  от 25.01.21 Окончание 02.02.2021

Начальная цена

—

Тальк молотый ТРПН ГОСТ 19729-74

 

Тальк молотый ТРПН ГОСТ 19729-74

Используется тальк молотый ТРПН ГОСТ 19729-74 для производства РТИ и шин. Специалисты считают этот материал отличным неактивным, усиливающим и инертным наполнителем. Он идеально подходит для создания эбонитовой резины и прочих технических изделий, который пользуются широким потреблением. Марка ТРПН активно используется в шинном производстве. Также ее могут использовать для разработки различных смесей, форм и заготовок, где необходима резина. Компания официально занимается добычей и продажей талька. Для этого применяются лучшие современные технологии. В России наибольшей популярностью пользуется именно Черемшанское месторождение, находится оно во Свердловской области. Там специалисты добывают материал. Он соответствует всем нормам и параметрам и на него установлена довольно выгодная цена.

Тальк ТРПН

Тальк ТРПН – очень распространенный и популярный материал. Чаще всего его используют во время производства шин, но также этот элемент может применяться еще и при создании резинотехнических изделий. Именно марка ТРПН указывает на то, что этот материал допустимо добавлять в составы резиновых товаров. В целом он считается инертным, неактивным и вдобавок усиливающим наполнителем. Все эти свойства идеально подходят для создания эбонитовой резины и прочих изделий из этого материала, которые находятся в широком потреблении.

Где применяется тальк молотый ТРПН?

Молотый тальк используется не только в резиновой промышленности. Его активно применяют бумажные и лакокрасочные производства из-за качеств, невысокой стоимости, надежности и долговечности. Найти применение можно даже в медицине или косметической, парфюмерной сфере. Во время создания какой-либо техники не обойтись и без талька молотого ТРПН, он используется как смазка твердого типа. Бывают и случаи, когда этот материал используется при создании керамики.

Специалисты утверждают, что молотый тальк может применяться и как антислеживатель. Такая функция необходима при строительстве и создании лодок, надувных бассейнов, пожарных рукавов. Туда пересыпают материал перед тем, как отправить изделие на длительное хранение. Это дает возможность избежать растрескивания, плюс значительно продлевается срок эксплуатации любого изделия из резины. Так что, рекомендуется купить микротальк ТРПН, чтобы улучшить характеристики продукта, созданием которого занимается предприятие.

Рекомендуется купить Тальк молотый ТРПН ГОСТ 19729-74 не только для промышленной, но и для бытовой или автомобильной отрасли. Все дело в том, что этот порошок довольно устойчив к щелочной, кислотной среде, поэтому он справится с любым химическим воздействием, ультрафиолетовым излучением, механическим и атмосферным влиянием.

Что касается сферы промышленности, то зачастую такой тип талька в компании заказывают для производства резины, пластмассы или керамики. Этот элемент используется как наполнитель, он отдает все свои полезные свойства, повышает качество. Что касается бытового применения, то очень часто тальк добавляют в детские присыпки. Также производитель утверждает, что этот материал может использоваться как присадка в машинном масле.

Особенности молотого микроталька

Специалисты считают молотый тальк гидрофобным наполнителем из-за его физико-химических характеристик. Материал действительно очень устойчив к воздействию различных химикатов, высоких температур, также стоит отметить, что он довольно атмосферостойкий, так что даже плохие погодные условия не смогут его повредить. Только в плавиковой среде микротальк сможет полностью разложиться.

________________________________________________________________________________

РЕКОМЕНДАЦИЯ! Лучше всего предварительно изучить условия использования данного материала, чтобы убедиться в том, что химикат не навредит эксплуатационным характеристикам. При соблюдении всех норм удастся использовать резину долгое время. Этому поспособствуют еще и улучшенные адсорбционные, диэлектрические свойства.

____________________________________________________________________________________________________________

Даже после значительной термической обработки прочность материала не ухудшится. Специалисты отмечают низкий уровень влагоемкости и минимальную усадку. Это отличные характеристики для резины, ведь тогда даже под давлением ее свойства практически не изменятся.

  

Тальк ТРПН: основные преимущества

Стоит тальк молотый недорого, но это не единственное достоинство. Компания добывает этот материал на Черемшанском месторождении в Свердловской области. Участок довольно большой, специалистам удается постоянно привозить новые качественные партии. Благодаря этому ни одному из производств, которое хочет обратиться в компанию за услугой и купить тальк, нет необходимости приостанавливать свой рабочий процесс. Сырье будет доставлено в сроки и удивит каждого своим высоким качеством. Установлена довольно выгодная цена.

Эта продукция востребованная и универсальная. Благодаря качественному месторождению в Свердловской области компании удается предоставлять только отборный материал. Стоит напомнить, что за тонну установлена довольно низкая цена. Выделяют такие достоинства талька молотого ТРПН:

• укрепляющее воздействие;
• высокий уровень теплостойкости;
• повышенные диэлектрические и электроизоляционные свойства;
• помогает избежать слипания и склеивания;
• в составе нет амфибол, кристаллического кварца;
• низкий уровень наличия тяжелых металлов.

С использованием этого вида талька производитель сможет создавать экологически чистую продукцию.

Также стоит отметить, что в тальке ТРПН практически нет тяжелых металлов. Это большой плюс, поскольку с такой точки зрения любое производство может создать экологически чистую и очень качественную продукцию. Конечно, для всего этого в обязательном порядке должен соблюдаться ГОСТ 19729-74. Нельзя превышать указанные в нем параметры даже на долю процента, поскольку в противном случае предполагаемые физические свойства ухудшатся. Использование посторонних примесей тоже недопустимо. Это приведет к тому, что применение талька в принципе окажется нецелесообразным. Вот почему важно обращаться только к проверенным поставщикам. Компания гарантирует высокое качество продукции и уверена в том, что потребитель не разочаруется. Лучше всего делать оптовый заказ. Это выгоднее и по цене, и по скорости доставки, плюс не придется лишний раз ждать сырье для производства еще одной партии резиновых изделий широкого потребления или шин.

________________________________________________________________________________

РЕКОМЕНДАЦИИ! Кстати, узнать, есть ли в продукции какие-то нежелательные добавки можно по ее цвету. Специалисты утверждают, что идеальное качество талька РТПН показывает его безупречный белый цвет. Это гарантия того, что состав полностью соответствует ГОСТу. Если же есть хотя бы небольшой желтый или коричневый оттенок, то это указывает на то, что поставщик решил схитрить, добавить в продукцию примести. Этот ход удешевляет процесс создания для него, но при этом потребитель получает товар низкого качества с плохими характеристиками.

____________________________________________________________________________________________________________

Что значит ГОСТ 19729-74

Для создания резины требуется тальк определенного качества, это обязательно влияет на механические характеристики изделия. Выбор, как правило, зависит от содержания железа в исходном материале. Прочие показатели особой роли не играют. Но желательно, чтобы в нем не было оксидов железа, поскольку это может значительно ускорить старение резины. ГОСТ 19729-74 контролирует качество талька молотого ТРПН. При добыче и продаже мастера ориентируются именно на эти нормы.

Выделяет ГОСТ такие стандарты:

• железо в вытяжке – максимум 0,9%;
• масса металлического железа – не более 0,04%.

Перед тем, как отправить материал на продажу, тальк обязательно строго проверяется на соответствие этим нормам. Выпускаемая продукция не может отклоняться от установленных ГОСТом показателей даже на 0,001%. Для обеспечения идеального качества и соответствия стандартам используются специальные технологии. Благодаря им резина будет не только прочной, но и устойчивой к щелочам, кислотам. Использоваться она может даже для создания пластиков. Тальк-наполнитель пригодится на любом производстве, стоит задуматься о заказе.

О требованиях безопасности

Тальк этой марки специалисты считают нетоксичным и малоопасным веществом, поэтому какие-то особые требования к нему не выдвигаются. При этом важно знать, что тальковая пыль неблагоприятно влияет на органы дыхательной системы, что может значительно ухудшить здоровье человека. Максимальный уровень концентрации талька в воздухе равен 4 мг на м3. Работая с этим материалом обязательно стоит использовать защитный респиратор. Об этом обычно говорят во время проведения инструктажа по технике безопасности. При правильной эксплуатации ТРПН тальк не навредит, а лишь улучшит качество резины, керамики или любой другой продукции, в состав которой он был добавлен.

Покупка этого материала особо не ударит по карману, поскольку компания предлагает очень выгодные расценки, при этом качество в обязательном порядке соответствует ГОСТу. Можно заказать порошок в любых объемах, но практика показывает, что производства чаще всего делают оптовые закупки для работы.

Строение и функция поры канала термоТРП

Обзор

DOI: 10.1016 / B978-0-12-800181-3.00009-9.

Принадлежности Расширять

Принадлежность

• ¹ Кафедра физиологии и мембранной биологии Медицинской школы Калифорнийского университета, Дэвис, Калифорния, США.

Элемент в буфере обмена

Обзор

Jie Zheng et al. Curr Top Membr. 2014 г.

Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

DOI: 10.1016 / B978-0-12-800181-3.00009-9.

Принадлежность

• ¹ Кафедра физиологии и мембранной биологии Медицинской школы Калифорнийского университета, Дэвис, Калифорния, США.

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplay

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Каналы термочувствительного переходного рецепторного потенциала (TRP) структурно подобны другим каналам тетрамерных катионов, но могут быть сильно активированы при нагревании.Недавние исследования показывают, что порообразующая область напрямую участвует в активации стробирования. В этой главе мы суммируем основные результаты как структурных, так и функциональных исследований, касающихся закрывающей роли области поры, уделяя особое внимание TRPV1. Возникающая картина заключается в том, что периферическая область S1-S4 TRPV1 является жесткой и играет поддерживающую роль для пор, чтобы претерпевать конформационные перестройки. Это помещает область поры в центр стробирования активации.

Ключевые слова: Аллостерическая муфта; Конформационная перестройка; Взаимосвязь структура – ​​функция; Чувствительность к температуре.

Похожие статьи

• Линкер S4 — S5 — редуктор стробирования каналов ТРП.

  Hofmann L, Wang H, Zheng W, Philipp SE, Hidalgo P, Cavalié A, Chen XZ, Beck A, Flockerzi V. Hofmann L, et al. Клеточный кальций. 2017 ноя; 67: 156-165. DOI: 10.1016 / j.ceca.2017.04.002. Epub 2017 4 апреля. Клеточный кальций. 2017 г. PMID: 28416203 Рассмотрение.

• Каналы ThermoTRP как модульные белки с аллостерическим гейтингом.

  Latorre R, Brauchi S, Orta G, Zaelzer C, Vargas G. Latorre R, et al. Клеточный кальций. 2007 октябрь-ноябрь; 42 (4-5): 427-38. DOI: 10.1016 / j.ceca.2007.04.004. Epub 2007 17 мая. Клеточный кальций. 2007 г. PMID: 17499848 Рассмотрение.

• Аллостеризм и структура в каналах термоактивированного переходного рецепторного потенциала.

  Диас-Франулич I, Поблете Х., Миньо-Галаз Дж., Гонсалес С., Латорре Р. Diaz-Franulic I, et al. Анну Рев Биофиз. 2016 5 июля; 45: 371-98. DOI: 10.1146 / annurev-biophys-062215-011034. Epub 2016 23 мая. Анну Рев Биофиз. 2016 г. PMID: 27297398 Рассмотрение.

• Измерение напряжения в каналах термо-ТРП.

  Браучи С., Орио П. Brauchi S, et al.Adv Exp Med Biol. 2011; 704: 517-30. DOI: 10.1007 / 978-94-007-0265-3_28. Adv Exp Med Biol. 2011 г. PMID: 212 Рассмотрение.

• Структура термически активируемых каналов TRP.

  Коэн MR, Моисеенкова-Белл В.Ю. Коэн MR, et al. Curr Top Membr. 2014; 74: 181-211. DOI: 10.1016 / B978-0-12-800181-3.00007-5. Curr Top Membr. 2014 г. PMID: 25366237 Бесплатная статья PMC.Рассмотрение.

Процитировано

18 артикул

• Нейрогенное вещество Р влияет на производство потенциала действия в афферентных нейронах почек?

  Родионова К., Хильгерс К.Ф., Линц П., Шетцль Дж., Рашке Г., Отт К., Шмидер Р.Э., Шиффер М., Аманн К., Велкен Р., Диттинг Т.Родионова К. и др. Pflugers Arch. 2021 Апрель; 473 (4): 633-646. DOI: 10.1007 / s00424-021-02552-z. Epub 2021 30 марта. Pflugers Arch. 2021 г. PMID: 33786667 Бесплатная статья PMC.

• Неортодоксальный механизм, лежащий в основе чувствительности ионного канала TRPV1 к напряжению.

  Ян Ф, Сюй Л., Ли Б. Х., Сяо Х, Яров-Яровой В., Чжэн Дж. Ян Ф и др. Adv Sci (Weinh). 2020 21 сентября; 7 (20): 2000575.DOI: 10.1002 / advs.202000575. eCollection 2020 Октябрь. Adv Sci (Weinh). 2020. PMID: 33101845 Бесплатная статья PMC.

• Молекулярные механизмы, лежащие в основе связывания ментола и активации ионного канала TRPM8.

  Xu L, Han Y, Chen X, Aierken A, Wen H, Zheng W, Wang H, Lu X, Zhao Z, Ma C, Liang P, Yang W, Yang S, Yang F. Xu L, et al. Nat Commun. 2020 29 июля; 11 (1): 3790.DOI: 10.1038 / s41467-020-17582-х. Nat Commun. 2020. PMID: 32728032 Бесплатная статья PMC.

• Парадигма тепловой адаптации у пингвинов и слонов путем настройки активации холода в TRPM8.

  Ян С., Лу Х, Ван И, Сюй Л., Чен Х, Ян Ф, Лай Р. Ян С. и др. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020, 14 апреля; 117 (15): 8633-8638. DOI: 10.1073 / pnas.1922714117. Epub 2020 27 марта.Proc Natl Acad Sci U S A. 2020. PMID: 32220960 Бесплатная статья PMC.

• Структурное понимание механизмов стробирования каналов TRPV.

  Пумрой Р.А., Флак EC 3rd, Ахмед Т., Моисеенкова-Белл В.Ю. Пумрой Р.А. и др. Клеточный кальций. 2020 Май; 87: 102168. DOI: 10.1016 / j.ceca.2020.102168. Epub 2020 24 января. Клеточный кальций. 2020. PMID: 32004816 Бесплатная статья PMC.Рассмотрение.

Типы публикаций

• Научно-исследовательская поддержка, N.I.H., заочная форма

Условия MeSH

• Каналы / химический состав транзиторных рецепторных потенциалов *
• Транзиторные потенциальные каналы рецепторов / генетика
• Возможные каналы / метаболизм транзиторных рецепторов *

Вещества

• Каналы транзиентного рецепторного потенциала

LinkOut — дополнительные ресурсы

• Источники полных текстов

• Другие источники литературы

Воздействие двух природных насыщенных N-ацилдопаминов на временные каналы рецепторного потенциала ваниллоида 1 (TRPV1)

Четыре длинноцепочечных линейных допамида жирных кислот (N-ацилдопамины) были идентифицированы в нервных тканях крупного рогатого скота и крысы.Было показано, что два ненасыщенных члена этого семейства липидов, N-арахидоноил-дофамин (NADA) и N-олеоил-дофамин, сильно активируют канал временного рецепторного потенциала типа V1 (TRPV1), также известный как ваниллоидный рецептор типа 1 для капсаицина. . Однако два других конгенена, N-пальмитоил- и N-стеароил-дофамин (PALDA и STEARDA), неактивны в отношении TRPV1. Мы исследовали здесь возможность того, что два соединения действуют, усиливая эффект NADA на TRPV1 (эффект «окружения»). При предварительной инкубации в течение 5 мин с клетками оба соединения дозозависимо усиливали TRPV1-опосредованный эффект NADA на внутриклеточный Ca (2+) в клетках эмбриональных почек человека, сверхэкспрессирующих TRPV1 человека.В присутствии либо PALDA, либо STEARDA (0,1-10 мкм) ЕС (50) NADA снижается примерно с 90 до примерно 30 нм. Эффект на внутриклеточный Ca (2+) другим эндованиллоидом, N-арахидоноилэтаноламином (анандамид, 50 нМ), также дозозависимо усиливался как PALDA, так и STEARDA. PALDA и STEARDA также действовали совместно с низким pH (6,0-6,7), увеличивая внутриклеточный Ca (2+) через TRPV1. При совместной инъекции с NADA (0,5 мкг) в задние лапы крысы STEARDA (5 мкг) усиливал TRPV1-опосредованный ноцицептивный эффект NADA, значительно сокращая латентный период отведения от теплового источника.STEARDA (1 и 10 микрограммов) также усиливал ноцистное поведение, вызванное каррагинаном в типичном тесте на воспалительную боль. Эти данные показывают, что, несмотря на их неактивность как таковую в отношении TRPV1, PALDA и STEARDA могут играть роль «окружающих» соединений в отношении химико-физических агентов, которые взаимодействуют с этими рецепторами, с возможными последствиями для воспалительной и невропатической боли.

Активация термочувствительных TRPV1-подобных рецепторов в нейронах ARC POMC снижает потребление пищи

Abstract

Проопиомеланокортин (POMC) нейроны в дугообразном ядре гипоталамуса (ARC) реагируют на многочисленные гормональные и нервные сигналы, что приводит к изменениям в потреблении пищи.Здесь мы демонстрируем, что нейроны ARC POMC экспрессируют чувствительные к капсаицину временные рецепторные потенциальные ваниллоидные 1 рецепторы (TRPV1) -подобные рецепторы. Чтобы показать экспрессию TRPV1-подобных рецепторов в нейронах ARC POMC, мы используем одноклеточную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR), иммуногистохимию, электрофизиологию, нокаут TRPV1 (KO) и мышей с нокаутом TRPV1-Cre. . Небольшого повышения температуры в физиологическом диапазоне достаточно для деполяризации нейронов ARC POMC. Эта деполяризация блокируется антагонистом рецептора TRPV1 и нокдауном гена Trpv1 .Активация, вызванная капсаицином, снижает потребление пищи, которое отменяется антагонистом рецепторов меланокортина. Для селективной стимуляции нейронов ARC POMC, экспрессирующих TRPV1-подобный рецептор в ARC, мы генерируем аденоассоциированный вирус серотипа 5 (AAV5), несущий Cre-зависимый канал экспрессии родопсина-2 (ChR2) с усиленной кассетой экспрессии желтого флуоресцентного белка (eYFP) под контроль двух нейрональных энхансеров POMC (nPE). Оптогенетическая стимуляция нейронов POMC, экспрессирующих TRPV1-подобный рецептор, снижает потребление пищи.Температура гипоталамуса быстро повышается и достигает примерно 39 ° C во время бега на беговой дорожке. Это повышение связано с уменьшением потребления пищи. Нокдаун гена Trpv1 исключительно в нейронах ARC POMC блокирует подавление питания, вызванное повышенной температурой гипоталамуса. Взятые вместе, наши результаты идентифицируют меланокортинергический контур, который связывает резкое повышение гипоталамической температуры с резким сокращением потребления пищи.

Сведения об авторе

Интенсивные упражнения резко снижают аппетит и последующее потребление пищи.Поскольку упражнения сопровождаются повышением температуры тела, мы предположили, что повышение температуры тела во время упражнений играет роль в сокращении потребления пищи. Гипоталамические нейроны являются основными компонентами нервных цепей, которые контролируют питание в ответ на гормоны и нервные сигналы. Среди нейронов гипоталамуса те, которые экспрессируют проопиомеланокортин (ПОМК) в дугообразном ядре гипоталамуса, важны для контроля потребления пищи. В этом исследовании мы обнаружили, что эти POMC-экспрессирующие нейроны экспрессируют TRPV1-подобные терморецепторы, которые активируются повышением температуры в пределах физиологического диапазона у мышей.Мы также показали, что повышение температуры тела во время упражнений непосредственно ощущается этими POMC-экспрессирующими нейронами через активацию TRPV1-подобных рецепторов. Таким образом, это исследование предлагает новый взгляд на клеточные механизмы, лежащие в основе энергетического баланса: температура тела снижает потребление пищи через TRPV1-подобные рецепторы в нейронах, экспрессирующих POMC, в дугообразном ядре гипоталамуса.

Образец цитирования: Jeong JH, Lee DK, Liu S-M, Chua SC Jr, Schwartz GJ, Jo Y-H (2018) Активация термочувствительных TRPV1-подобных рецепторов в нейронах ARC POMC снижает потребление пищи.ПЛоС Биол 16 (4): e2004399. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399

Академический редактор: Чарльз Бурк, Центр исследований в области неврологии Макгилла, Канада

Поступила: 2 октября 2017 г .; Принята к печати: 20 марта 2018 г .; Опубликован: 24 апреля 2018 г.

Авторские права: © 2018 Jeong et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: NIDDK (номер гранта DK020541). получено Y-HJ, SC и GS. Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи. NIDDK (номер гранта DK092246). получил Y-HJ. Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: AAV1, аденоассоциированный вирус серотипа 1; AAV5, аденоассоциированный вирус серотипа 5; ACSF, искусственная спинномозговая жидкость; AgRP, родственный агути пептид; ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; CB1, каннабиноидный рецептор 1 типа; ChR2, каналродопсин-2; CNO, клозапин-N-оксид; CNQX, 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион; Cre, Cre-рекомбиназа; CRISPR / Cas-9, кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы / CRISPR-ассоциированный белок 9; ДИО, двойная перевернутая открытая рамка считывания; УЖАСЬ, дизайнерские рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими наркотиками; eGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; Бывший, упражнение; eYFP, улучшенный YFP; Гад2 , г. глутаматдекарбоксилаза 2; Клетки НЕК293, клетки 293 эмбриональной почки человека; hSyn, промотор синапсина I человека; я.п., Внутрибрюшинно; КО, Вырубить; MC3 / 4R, рецептор меланокортина 3 и 4; мЧерри, мономерный вишневый флуоресцентный белок; мРНК, информационная РНК; НПЭ, нейрональный энхансер POMC; NPY, нейропептид Y; POMC, проопиомеланокортин; КПЦР, количественная полимеразная цепная реакция; ОТ-ПЦР, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; RTX, резинифератоксин; sgRNA, одиночная направляющая РНК; shRNA, короткая шпильочная РНК; TRPV, переходный рецепторный потенциал ваниллоида; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного 1 рецептора; ТТХ, тетродотоксин; Veh, транспортное средство; WTA, полнотранскриптомная амплификация; YFP, желтый флуоресцентный белок; α-МСГ, α-меланоцитстимулирующий гормон

Введение

Температура тела изменяется в зависимости от циркадного ритма, физической активности и внешних факторов, таких как прием пищи [1–3].Хотя ожидается, что повышение температуры тела быстро передается в гипоталамус через кровоток, физиологические последствия такого повышения температуры гипоталамуса не изучены. Временные рецепторные потенциальные члены ванилоидного подсемейства 1–4 (TRPV1, 2, 3 и 4) в периферических сенсорных нейронах играют роль в точном измерении температуры окружающей среды и в адаптации к изменениям температуры окружающей среды посредством поведенческих и физиологических реакций [4–9]. В начале 1960-х Накаяма и его коллеги показали, что локальное нагревание гипоталамуса от 36 °.От 7 ° C до 38,7 ° C увеличивается активность нейронов гипоталамуса [10], что свидетельствует о том, что, как и периферические сенсорные нейроны, нейроны гипоталамуса способны реагировать на изменения температуры, возможно, через активацию чувствительных к температуре временных ваниллоидных каналов рецепторного потенциала (TRPV). Действительно, нейрофизиологические, генетические исследования и исследования гибридизации in situ описали экспрессию рецепторов TRPV, в частности каналов TRPV1, особенно в нейронах гипоталамуса [11–14].

Однако наличие функционального TRPV1 в гипоталамусе все еще остается спорным.Фактически, исследования на мышах-репортерах TRPV1 показали очень ограниченную экспрессию рецепторов TRPV1 в гипоталамусе [12]. Во-вторых, нейроны вазопрессина, экспрессирующие TRPV1, демонстрируют чувствительные к температуре внутренние токи при температурах выше 35 ° C [13,15,16], что противоречит ранее полученным данным о том, что рекомбинантные рецепторы TRPV1 активируются только при вредных температурах (> 42 ° C. ) [4]. В-третьих, анализ транскриптома нейронов агути-родственного пептида (AgRP) и проопиомеланокортина (POMC) в дугообразном ядре гипоталамуса (ARC) не показывает экспрессии транскриптов Trpv1 [17].Интересно, что некоторые нейроны ARC POMC расположены за пределами гематоэнцефалического барьера [18,19], что позволяет им обнаруживать резкие изменения температуры. Поэтому мы стремились определить, экспрессируют ли нейроны ARC POMC термочувствительные рецепторы TRPV1.

Используя несколько независимых методов, мы обнаружили, что нейроны ARC POMC экспрессируют капсаицин- и чувствительные к температуре рецепторы, содержащие субъединицу TRPV1 (TRPV1-подобные). Фармакологическая и оптогенетическая активация нейронов ARC POMC, экспрессирующих TRPV1-подобные каналы, снижает потребление пищи.Повышенная температура тела во время упражнений передавалась на АРК. Это повышение было связано с уменьшением потребления пищи, которое блокировалось антагонистом рецепторов меланокортина. Эти результаты подтверждают интерпретацию, согласно которой активация капсаицин-чувствительных TRPV1-подобных рецепторов в нейронах ARC POMC способствует регуляции острого приема пищи.

Результаты

ARC POMC нейроны экспрессируют капсаицин-чувствительные TRPV1-подобные рецепторы

ARC экспрессирует участки связывания мРНК Trpv1, и [ ³ H] резинифератоксина (RTX) [11,14].Среди класса каналов TRPV только каналы TRPV1 реагируют на капсаицин [4,20–23]. Следовательно, мы исследовали, реагируют ли нейроны ARC POMC на селективный агонист рецептора TRPV1 капсаицин [24–26]. Мембранные потенциалы регистрировали с нейронов ARC POMC-усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) в срезах гипоталамуса мышей POMC-eGFP в присутствии синаптических блокаторов (6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион [CNQX], 10 мкМ и пикротоксин 100 мкМ). Обработка капсаицином (100 нМ) значительно деполяризовала и запускала потенциалы действия в нейронах ARC POMC (S1A и S1B фиг.).Кроме того, обработка другим мощным и селективным агонистом рецептора TRPV1 RTX [27] (100 нМ) также деполяризовала ARC POMC, но не нейропептид Y (NPY) нейроны (S1C, S1D, S5B и S5C, фиг.). Индуцированная капсаицином деполяризация полностью блокировалась обработкой антагонистом рецептора TRPV1 AMG9810 (10 мкМ) [28] (S1E и S1F фиг.). Кроме того, деполяризация, вызванная рецептором TRPV1, все еще присутствовала в присутствии тетродотоксина (TTX) (S1G и S1H фиг.). Эти фармакологические результаты подтверждают существование функциональных капсаицин-чувствительных каналов TRPV1, экспрессируемых нейронами ARC POMC.

Затем мы провели одноклеточную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и иммуногистохимию для определения экспрессии капсаицин-чувствительных рецепторов TRPV1 в нейронах ARC POMC. Анализ одноклеточной RT-PCR нейронов ARC POMC показал, что примерно две трети исследованных нейронов ARC POMC содержали Trpv1 и матричную РНК (мРНК) (рис. 1A, n = 21 из 34 нейронов). Помимо экспрессии транскриптов Trpv1 , некоторые нейроны ARC POMC экспрессировали мРНК Trpv3 и Trpv4 (S2 фиг.).Предыдущее исследование транскриптома, в котором GFP-меченые нейроны POMC были выделены при комнатной температуре (24 ° C), показало отсутствие мРНК Trpv1 в нейронах ARC POMC [17]. Мы дополнительно исследовали экспрессию мРНК Trpv1 и в нейронах ARC POMC из срезов гипоталамуса, хранящихся при комнатной температуре. Мы обнаружили, что эта низкотемпературная обработка сильно подавляла уровни мРНК Trpv1 , хотя количество нейронов ARC POMC, экспрессирующих мРНК глутаматдекарбоксилазы 2 ( Gad2 ), было сходным с тем, которое наблюдалось при 36 ° C (S3 Фиг.).Таким образом, методологические различия в температурах, при которых ткань была изолирована, могут объяснить предыдущие неудачи в идентификации транскриптов Trpv1 в нейронах ARC POMC.

Рис. 1. Нейроны ARC POMC экспрессируют термочувствительные рецепторы TRPV1.

(A) Анализ одноклеточной RT-PCR нейронов POMC, показывающий экспрессию мРНК Trpv1 . Изображения, показывающие нейроны POMC-eGFP в срезах гипоталамуса (слева). Справа: транскрипты были собраны с 20 различных нейронов POMC (дорожка, 1–20).L: лестница ( Trpv1 , 120 п.н .; Pomc , 170 п.н .; 18S рРНК , 121 п.н.). П: положительный контроль. (B) Изображения флуоресцентной конфокальной микроскопии, показывающие экспрессию рецептора TRPV1 в ARC мышей WT и TRPV1 KO. Масштабная линейка: 100 мкм. (C) Экспрессия рецептора TRPV1 в ARC мышей WT и TRPV1 KO. (D) Изображения флуоресцентной конфокальной микроскопии, показывающие экспрессию рецептора TRPV1 (красный) в ARC мышей POMC-eGFP. Стрелки представляют собой TRPV1-положительные нейроны ARC POMC.Масштабная линейка: 20 мкм. (E) Изображения флуоресцентной конфокальной микроскопии, показывающие TRPV1-рецептор-положительные нейроны POMC (красный) в ARC мышей TRPV1-Cre, которым инъецировали AAV5-DIO-GFP (стрелки). Примерно 90% GFP-положительных клеток содержали POMC ( n = 357 из 401 GFP-положительных клеток, n = 3 мыши). Масштабная линейка: 20 мкм. (F) Репрезентативные кривые, показывающие деполяризацию нейронов POMC в ответ на повышение температуры. Эта деполяризация отменялась антагонистом рецептора TRPV1 и нокдауном рецептора TRPV1 с помощью shRNA рецептора TRPV1.Шкала: 25 мВ, 1 мин. (G) Объединенные данные среднего мембранного потенциала в ответ на повышение температуры ванны с 34 ° C до 38 ° C (контроль, n = 10 нейронов, AMG9810 [10 мкМ], n = 11 нейронов и Trpv1 shРНК, n = 11 нейронов, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 против 34 ° C). (H) Объединенные данные среднего мембранного потенциала при 34 ° C и 38 ° C (38 ° C, контроль, ΔVm, 11,6 ± 2,1 мВ, n = 10 нейронов, AMG9810, ΔVm, 2.5 ± 0,5 мВ, n = 11 нейронов, TRPV1 shRNA, ΔVm, 3,6 ± 1,0 мВ, n = 11 нейронов, ** p <0,01, *** p <0,001 против 34 ° C) . Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. AAV5, аденоассоциированный вирус серотипа 5; ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; DIO, перевернутая открытая рамка считывания с двойным флоком; GFP, зеленый флуоресцентный белок; КО, нокаут; ПОМК, проопиомеланокортин; ОТ-ПЦР, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; shRNA, короткая шпилечная РНК; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1; VMH, вентромедиальное ядро ​​гипоталамуса; WT, дикий тип; 18S, 18S рибосомная РНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.g001

Иммуноокрашивание нейронов ARC POMC антителом против рецептора TRPV1 показало, что рецептор-позитивные клетки TRPV1 в ARC контрольных животных (рис. 1B и S4A). . Однако у мышей с нокаутом по TRPV1 (KO) меченых клеток не наблюдалось (рис. 1B). Кроме того, вестерн-блоттинг показал TRPV1-положительный сигнал в лизатах от ARC контрольных мышей, но не TRPV1 KO мышей (рис. 1C). Важно отметить, что иммуноокрашивание, количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР) и вестерн-блоттинг не показали экспрессии рецепторов TRPV1 вокруг ARC (S4B, S4C и S4D, фиг.).Все эти результаты обеспечивают специфичность антител против TRPV1, которые мы использовали в этом исследовании.

Эксперименты по двойному иммуномечению с антителом против POMC показали, что большинство TRPV1-рецептор-положительных клеток в ARC были нейронами, содержащими POMC (рис. 1D, 96,3 ± 0,3%; n = 3 мыши), что согласуется с нашими нейрофизиологическими результатами. Напротив, очень немногие нейроны, экспрессирующие нейропептид Y, в ARC экспрессировали рецепторы TRPV1 (фиг. S5A; 1,6 ± 0,7% TRPV1-положительных нейронов; n = 3 мыши).Для дальнейшего изучения экспрессии рецепторов TRPV1 в нейронах ARC POMC мы использовали модель животных с нокаутом TRPV1-Cre [12]. Аденоассоциированный вирус серотипа 1 (AAV1), кодирующий Cre-индуцибельный GFP (AAV1-DIO-GFP), вводили в ARC мышей TRPV1-Cre. Через две недели после вирусных инъекций мы иммуноокрашивали срезы гипоталамуса антителами против GFP и против POMC. Мы обнаружили, что ARC содержал GFP-экспрессирующие клетки в ARC, подтверждая экспрессию TRPV1-положительных клеток в этой области. Важно отметить, что GFP-положительные клетки также экспрессировали POMC (рис. 1E).Эти результаты применения молекулярных, генетических и иммуногистохимических подходов убедительно подтверждают интерпретацию того, что популяция нейронов ARC POMC экспрессирует капсаицин-чувствительные рецепторы TRPV1, и обеспечивают наше обоснование для последующего исследования роли рецепторов TRPV1 в нейронах ARC POMC в регуляции кормления мышей.

ARC POMC нейроны экспрессируют функциональные термочувствительные TRPV1-подобные рецепторы

Повышенная температура активирует капсаицин-чувствительные рецепторы TRPV1 [4].Мы исследовали нейрофизиологическое влияние температуры на активность нейронов РОМС, экспрессирующих TRPV1. Записи с фиксацией напряжения целых клеток получали от нейронов ARC POMC в присутствии синаптических блокаторов (CNQX, 10 мкМ и пикротоксин, 100 мкМ) и TTX (0,5 мкМ). Повышение температуры ванны с 34 ° C до 38 ° C вызвало внутренний ток в нейронах ARC POMC (S6A и S6B, фиг.). Кроме того, эти тепловые стимулы значительно деполяризовали нейроны ARC POMC в конфигурациях токового зажима в присутствии синаптических блокаторов (рис. 1F, 1G и S6C).Примерно 40% нейронов POMC не реагировали на повышение температуры (S6D и S6E фиг.). Эта деполяризация блокировалась антагонистом рецептора TRPV1 AMG9810 и нокдауном гена Trpv1 с помощью короткой шпилечной РНК (shRNA) в ARC (рис. 1F, 1G и 1H). Напротив, нейроны NPY не реагировали на повышение температуры (S5D и S5E фиг.). Было продемонстрировано, что рекомбинантные рецепторы TRPV1 реагировали только на вредные температуры (> 42 ° C) [4]. Интересно, что рецепторы TRPV могут объединяться в гетеромерные каналы, а гетеромерные рецепторы TRPV1 с другими субъединицами TRPV изменяют температурную чувствительность [23,29].Например, каналы TRPV1 / TRPV3 имели более низкую пороговую температуру, около 34 ° C [23]. Важно отметить, что чувствительность к капсаицину гетеромерных каналов TRPV определялась присутствием субъединиц TRPV1 [23]. Поскольку нейроны ARC POMC имели мРНК Trpv3 и Trpv4 вместе с мРНК Trpv1 , мы исследовали, влияет ли нокдаун генов Trpv3 и Trpv4 в ARC на термочувствительность. Нейроны POMC у мышей, которым инъецировали кшРНК Trpv3 и Trpv4 , были менее чувствительны к повышенной температуре (S7A и S7B фиг.).Таким образом, наши результаты предполагают, что нейроны ARC POMC экспрессируют гетеромерные TRPV-каналы, содержащие субъединицу рецептора TRPV1 (следовательно, мы описываем их как «TRPV1-подобные»).

Деполяризация, вызванная капсаицином, снижает потребление пищи

Учитывая, что нейроны ARC POMC играют роль в контроле приема пищи [30–34], мы спросили, достаточно ли активации TRPV1-подобных рецепторов в нейронах ARC POMC для снижения потребления пищи. Чтобы проверить эту возможность, животных не кормили в течение 6 часов (с 13:00 до 19:00) перед инфузией лекарственного средства, а капсаицин вводили непосредственно в ARC.Локальная микроинъекция капсаицина (100 нМ) значительно снижает потребление пищи (рис. 2A, 2B и 2C). Этот анорексигенный эффект был заблокирован местной инъекцией AMG9810 (рис. 2D). Генетическое подавление гена Trpv1 путем инъекции кшРНК Trpv1 в ARC также устраняет эффект капсаицина (рис. 2E, 2F, 2G, 2H и таблица S1). Следовательно, активация капсаицин-чувствительных TRPV1-подобных рецепторов в ARC снижает потребление пищи.

Рис. 2. Активация рецепторов TRPV1 в ARC снижает потребление пищи.

(A) Схематический чертеж нашей экспериментальной конфигурации (левая панель). Физический раствор и лекарственное средство вводили в ARC мышей POMC-GFP (правая панель). (B) Схема измерения потребления пищи. (C) Объединенные данные 17 мышей, принимавших пищу после локальной микроинъекции капсаицина в ARC. * p <0,05, *** p <0,001. (D) Объединенные данные от 7 мышей, показывающие блокировку действия капсаицина с помощью AMG9810 (3 мкг / мкл).*** p <0,001, * p <0,05. (E) Схематическое изображение нашей экспериментальной конфигурации. shRNA вводили двусторонне в ARC (левая панель). Изображения флуоресцентной микроскопии, показывающие трансфекцию контрольной кшРНК в ARC (правая панель). Белый овальный круг показывает место инъекции shRNA. (F) Экспрессия мРНК Trpv1 у мышей, которым инъецировали контрольную и кшРНК Trpv1 . мРНК экстрагировали из ARC мышей, которым инъецировали контроль ( n = 6 животных) и Trpv1 shРНК ( n = 6 животных). Tprv1 Экспрессия мРНК была значительно снижена при инъекции кшРНК TRPV1 (** p <0,01). (G и H) Объединенные данные, показывающие, что капсаицин больше не снижает потребление пищи у мышей, которым вводили Trpv1 shRNA в ARC (контрольная sgRNA, n = 9 мышей; Trpv1 sgRNA, n = 9 мышей). ** p <0,01, *** p <0,001. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; кап, капсаицин; GFP, зеленый флуоресцентный белок; ПОМК, проопиомеланокортин; солевой, физиологический раствор; sgRNA, одиночная направляющая РНК; shRNA, короткая шпилечная РНК; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.g002

Затем мы исследовали, снижает ли вызванная капсаицином деполяризация нейронов ARC POMC потребление пищи. Мы экспрессировали ингибирующие дизайнерские рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADD) в нейронах ARC POMC, путем инъекции Cre-зависимого AAV5-G _{i / o} -DREADD- мономерного флуоресцентного белка вишни (mCherry) в ARC POMC-Cre. животные (рис. 3А). Через две недели после таких инъекций вируса в ARC наблюдалась экспрессия mCherry-позитивных клеток (рис. 3B).Более 90% положительных по mCherry клеток содержали POMC (рис. 3B). Обработка клозапин-N-оксидом (CNO) (10 мкМ) подавляла активность mCherry-положительных нейронов POMC и блокировала эффект RTX в препаратах гипоталамических срезов (рис. 3B). В исследованиях in vivo на этих животных внутрибрюшинное введение только CNO не изменяло потребление пищи, как описано в предыдущих исследованиях [35]. Однако CNO-индуцированное ингибирование нейронов ARC POMC было достаточным, чтобы блокировать эффект капсаицина на потребление пищи (рис. 3C и 3D и таблица S1), что позволяет предположить, что ингибирование нейронов ARC POMC противодействует индуцированному капсаицином возбуждению нейронов ARC POMC.

Рис. 3. Активация рецепторов TRPV1 в нейронах ARC POMC снижает потребление пищи.

(A) Схематическое изображение нашей экспериментальной конфигурации, показывающее, что Cre-индуцибельный AAV-G _{i / o} -DREADD был введен в ARC мышей POMC-Cre. (B) Экспрессия G _{i / o} -DREADD в нейронах POMC в ARC (верхняя левая панель, масштабная линейка: 20 мкм). Стрелки представляют собой нейроны POMC, ко-экспрессирующие mCherry ( n = 493 из 529 mCherry-позитивных нейронов, n = 3 мыши).Обработка CNO (10 мкМ) гиперполяризованных нейронов POMC (верхняя правая панель; контроль, -40,7 ± 1,5 мВ; CNO, -47,1 ± 2,3 мВ, n = 6 нейронов, ** p <0,01). Шкала: 25 мВ, 2 мин. Нижняя панель: В присутствии CNO обработка агонистом TRPV1 не способна деполяризовать нейроны POMC ( n = 3 нейрона). Шкала: 20 мВ, 100 с. ( C и D ) Объединенные данные от 8 мышей, показывающие блокировку эффекта капсаицина путем активации G _{i / o} -DREADD в нейронах ARC POMC.** p <0,01, *** p <0,001. (E) Объединенные данные от 11 мышей, показывающие блокировку эффекта капсаицина антагонистом рецептора MC3 / 4 SHU9119 (5 мкМ). р > 0,05. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. AAV, аденоассоциированный вирус; ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; кап, капсаицин; CNO, клозапин-N-оксид; Cre, Cre рекомбиназа; DREADD, дизайнерский рецептор, активируемый исключительно дизайнерскими наркотиками; hSyn, промотор синапсина I человека; внутрибрюшинно, внутрибрюшинно; mCherry, мономерный флуоресцентный белок вишни; MC3 / 4, меланокортин 3/4; ПОМК, проопиомеланокортин; RTX, резинифератоксин; солевой, физиологический раствор; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.g003

Нейроны ARC POMC синтезируют и выделяют пептиды, производные от POMC, такие как анорексигенный α-меланоцит-стимулирующий гормон (α-MSH) [36,37] и деполяризацию. нейронов ARC POMC высвобождает α-MSH, что приводит к снижению потребления пищи [36]. Мы проверили, вызван ли анорексигенный эффект капсаицина высвобождением альфа-МСГ. Мы интрацеребровентрикулярно вводили антагонист рецептора меланокортина 3/4 SHU9119 перед местной инъекцией капсаицина.В то время как инъекция SHU9119 не имела эффекта кормления при введении отдельно (фиг. 3E), предварительная обработка SHU9119 отменяла анорексигенный эффект капсаицина (фиг. 3E и таблица S1). Напротив, капсаицин все еще был эффективен в снижении потребления пищи в присутствии антагониста опиоидного рецептора налоксона (1 мМ; S8 фиг.). Наши результаты подтверждают интерпретацию, что активация TRPV1-подобного рецептора вызывает высвобождение анорексигенного α-MSH из нейронов ARC POMC и, следовательно, снижает потребление пищи.

Активация TRPV1-подобных рецепторов, экспрессируемых в нейронах POMC, снижает кормление

Затем мы исследовали, регулирует ли активация TRPV1-подобных рецепторов, экспрессируемых исключительно в нейронах ARC POMC, питание. С этой целью мы использовали Cre-зависимую кластерную систему с регулярными интервалами коротких палиндромных повторов / CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR / Cas-9), чтобы заглушить ген Trpv1 в нейронах ARC POMC. Мы скрестили POMC-Cre с мышами floxed-stop CRISPR / Cas-9-eGFP для получения мышей POMC-Cre ;; CRISPR / Cas-9-eGFP (рис. 4A).Мы вводили Trpv1 одиночную направляющую РНК (sgRNA) в ARC этих мышей, а затем исследовали, реагируют ли нейроны ARC POMC на капсаицин. Иммуногистохимические эксперименты с антителом к ​​белку c-fos показали, что локальная инъекция капсаицина индуцировала экспрессию белка c-fos в нейронах ARC POMC у контрольных мышей, тогда как мыши, которым вводили sgRNA Trpv1 в нейроны ARC POMC, не демонстрировали экспрессии белка c-fos. в ответ на капсаицин (рис. 4B, 4C и 4D). Более того, средняя амплитуда термочувствительных токов в нейронах POMC от мышей, которым инъецировали Trpv1 sgRNA, была значительно меньше, чем наблюдаемая в контроле (S6A и S6B фиг.).

Рис. 4. Нокдаун гена Trpv1 в нейронах ARC POMC блокирует анорексигенный эффект капсаицина.

(A) Изображения флуоресцентной конфокальной микроскопии, показывающие GFP-положительные нейроны POMC в ARC мышей POMC-Cre :: CRISPR-Cas-9-eGFP. Масштабная линейка: 50 мкм. (B) Изображения флуоресцентной конфокальной микроскопии, показывающие, что локальная инъекция капсаицина индуцировала экспрессию белка c-fos в нейронах POMC в ARC. (C) Изображения флуоресцентной конфокальной микроскопии, показывающие, что локальная инъекция капсаицина не индуцирует экспрессию белка c-fos у мышей, лишенных рецепторов TRPV1 в нейронах ARC POMC.Масштабная линейка: 50 мкм. (D) Объединенные данные показывают процент нейронов POMC, экспрессирующих белок c-fos, у контрольных мышей и мышей, лишенных рецепторов TRPV1, в нейронах ARC POMC после обработки физиологическим раствором и капсаицином ( n = 5, 5 и 3 животных, соответственно. ). (E и F) Схематическое изображение нашей экспериментальной конфигурации. Trpv1 sgRNA вводили с двух сторон в ARC мышей POMC-Cre и POMC-Cre :: CRISPR-Cas-9-eGFP ( E ).Прямая инъекция капсаицина в ARC не снижает потребление пищи мышами, подавляя ген Trpv1 в нейронах ARC POMC ( F ) ( n = 6 и 7 мышей, соответственно). Мышей не кормили в течение 6 часов (с 13:00 до 19:00) *** p <0,001. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; кап, капсаицин; Cre, Cre рекомбиназа; CRISPR-Cas-9, регулярно сгруппированные короткие палиндромные повторы / CRISPR-ассоциированный белок 9; eGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; GFP, зеленый флуоресцентный белок; ПОМК, проопиомеланокортин; солевой, физиологический раствор; sgRNA, одиночная направляющая РНК; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.g004

Учитывая, что анорексигенный эффект капсаицина отменяется антагонистом рецепторов меланокортина 3 и 4 (MC3 / 4R), мы ожидали, что введение капсаицина не поможет. уменьшить потребление пищи у мышей, подавляя ген Trpv1 в нейронах ARC POMC. Действительно, капсаицин не влиял на кормление в этой животной модели, тогда как мыши POMC-Cre, инъецированные sgRNA Trpv1 , по-прежнему демонстрировали снижение потребления пищи после лечения капсаицином (рис. 4E и 4F).Наши результаты оказались несовместимыми с предыдущими исследованиями, показавшими, что стимуляция всей популяции нейронов ARC POMC не снижает потребление пищи [35,36,38]. Таким образом, мы исследовали, снижает ли активация нейронов ARC POMC, экспрессирующих TRPV1-подобный рецептор, потребление пищи. Чтобы избирательно стимулировать нейроны POMC, экспрессирующие TRPV1-подобный рецептор в ARC, мы создали AAV5, несущий Cre-зависимый канал родопсина-2 (ChR2) — усиленную кассету экспрессии желтого флуоресцентного белка (eYFP) под контролем двух нейрональных энхансеров POMC ( nPE1 и nPE2) (AAV5-nPE-DIO-ChR2-YFP, фиг. 5A).Было показано, что эти энхансеры управляют экспрессией репортерного гена в нейронах ARC POMC [39]. Мы вводили этот вирусный вектор в ARC мышей TRPV1-Cre, ожидая, что только нейроны POMC, экспрессирующие TRPV1-подобный рецептор, среди всей популяции нейронов ARC POMC будут экспрессировать ChR2. Через восемь недель после вирусных инъекций мы обнаружили экспрессию репортерного белка в нейронах POMC в ARC (рис. 5B). Важно отметить, что оптогенетическая стимуляция этих нейронов с частотой 10 Гц в течение 1 часа значительно снижает потребление пищи (рис. 5C и 5D).Наши результаты подтверждают интерпретацию, что, вопреки предыдущим открытиям [35,36,38], селективной стимуляции определенного подмножества нейронов ARC POMC (т.е. экспрессии рецептора TRPV1-подобного типа) достаточно для уменьшения потребления пищи.

Рис. 5. Активация нейронов POMC, экспрессирующих TRPV1-подобный рецептор, снижает питание.

(A) Схематическое изображение Cre-зависимого вектора AAV с двойным флоксом, экспрессирующего ChR2-eYFP под контролем nPE-глобина. (B) Изображения конфокальной микроскопии, показывающие коэкспрессию POMC и YFP в ARC мышей TRPV1 Cre, которым инъецировали AAV5-nPE-глобин-DIO-ChR2-eYFP в ARC (стрелки; верхняя панель).Нижняя панель: Коэкспрессия TRPV1 и YFP (стрелки). Масштабная линейка: 20 мкм. (C) Схематический рисунок нашей экспериментальной конфигурации. Вирусы AAV5-nPE-ChR2 вводили двусторонней инъекцией в ARC мышей TRPV1-Cre. Оптическая канюля была имплантирована в ARC для оптогенетической стимуляции нейронов POMC, экспрессирующих TRPV1-подобный рецептор. (D) Объединенные данные, показывающие эффект оптогенетической стимуляции РОМС, экспрессирующего TRPV1-подобный рецептор, в ARC. Десятигерцовая стимуляция значительно снизила потребление пищи в течение 1 ч (без стимуляции, 2.1 ± 0,04 мл; при стимуляции 0,6 ± 0,04 мл, n = 7 мышей, *** p <0,001). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. AAV, аденоассоциированный вирус; ChR2, канал родопсин-2; Cre, Cre рекомбиназа; DIO, перевернутая открытая рамка считывания с двойным флоком; eYFP, улучшенный YFP; ITR, инвертированный концевой повтор; LoxP , локус X (кросс-овер) в P1; nPE, нейрональный энхансер POMC; ПОМК, проопиомеланокортин; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1; ТТХ, тетродотоксин; WPRE, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка; YFP, желтый флуоресцентный белок.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.g005

Повышение температуры тела приводит к повышению температуры АРО

Небольшое повышение температуры в пределах физиологического диапазона (от 37 ° C до 38 ° C) активировало TRPV1-подобные рецепторы в нейронах ARC POMC в срезах гипоталамуса. Мы спросили, испытывает ли температура ARC такое повышение при нормальных физиологических условиях. Было показано, что физические упражнения повышают не только температуру тела, но и головного мозга [40].Таким образом, мы измерили как ARC, так и температуру тела во время 40-минутного бега на беговой дорожке у обученных мышей (рис. 6A и 6B и ролик S1). Это упражнение быстро подняло температуру тела, а также температуру ARC (рис. 6B и 6C). Температура ARC достигла плато после 20 минут упражнений и оставалась высокой более 1 часа.

Рис. 6. Физические упражнения повышают температуру тела и АРО.

(A) Схема, изображающая протокол беговой дорожки мыши. Мышей всегда прогревали в течение 5 минут со скоростью 7 м / мин, и скорость медленно увеличивали до 18 м / мин. (B и C) Объединенные данные, показывающие изменения температуры тела и ARC во время бега на беговой дорожке (серая линия, разминка в течение 5 минут и черная линия, бег в течение 35 минут [ B ]). График, показывающий среднюю температуру через 0, 5 и 40 минут упражнений (через 40 минут средняя температура тела 38,9 ± 0,1 ° C; средняя температура ARC 38,6 ± 0,2 ° C). (D) Объединенные данные от 9 мышей, показывающие влияние физических упражнений на потребление жидкой пищи в течение 1 часа (* p <0,05, *** p <0.001). (E) Объединенные данные от 9 мышей, показывающие влияние физических упражнений на потребление пищи в течение 1 часа с антагонистом MC3 / 4R. Вызванный физическими упражнениями анорексигенный эффект отменялся местной инъекцией SHU9001. (F) Объединенные данные от 9 мышей, показывающие влияние физических упражнений на потребление пищи в течение 1 часа у мышей, которым вводили контрольную sgRNA. Вызванный физической нагрузкой анорексигенный эффект отсутствует у мышей, подавляющих ген Trpv1 в нейронах ARC POMC. * p <0,05, ** p <0.01, *** р <0,001. (G) Объединенные данные от 9 мышей, показывающие влияние физических упражнений на потребление пищи в течение 1 часа у мышей, подавляющих ген Trpv1 в нейронах POMC. Физические упражнения больше не снижают потребление пищи у мышей, лишенных гена Trpv1 в нейронах POMC. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; Ex, упражнение; MC3 / 4R, рецептор меланокортина 3 и 4; ПОМК, проопиомеланокортин; sgRNA, одиночная направляющая РНК; Trpv1 , временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1; Veh, автомобиль.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.g006

Мы стремились определить, связано ли это повышение температуры ARC с уменьшением питания за счет активации TRPV1-подобных рецепторов в нейронах ARC POMC. Мышам давали жидкую пищу после завершения тренировки, чтобы измерить резкие изменения в потреблении пищи (рис. 6D). Мы обнаружили, что тренированные мыши потребляли значительно меньше пищи, чем не тренированные мыши (рис. 6D). Важно отметить, что анорексигенный эффект упражнений был отменен введением антагониста MC3 / 4R SHU9119 (рис. 6E и таблица S2), что свидетельствует о том, что вызванное упражнениями повышение температуры ARC активирует нейроны ARC POMC.Чтобы дополнительно определить эту возможность, мы измерили потребление пищи у мышей, подавляющих ген Trpv1 в нейронах ARC POMC после тренировки. Мы обнаружили, что, хотя мыши, которым вводили контрольную sgRNA, показали снижение потребления пищи (рис. 6F), упражнения не влияли на потребление пищи у мышей, подавляя ген Trpv1 в нейронах ARC POMC (рис. 6G и таблица S2). Следовательно, наши результаты предполагают, что повышенная температура гипоталамуса может активировать чувствительные к температуре TRPV1-подобные рецепторы в нейронах ARC POMC, что может привести к снижению потребления пищи.

Обсуждение

Все результаты нейрофизиологических, молекулярных, генетических и иммуногистохимических исследований предоставили доказательства того, что нейроны ARC POMC экспрессируют функциональные каналы TRPV1. Нейроны ARC POMC были чувствительны к капсаицину, но активировались физиологической теплой температурой около 37 ° C, что позволяет предположить, что нейроны ARC POMC могут экспрессировать гетеромерные, а не гомомерные рецепторы TRPV1. Фактически, подмножество нейронов ARC POMC содержало транскрипты Trpv3 и Trpv4 .Фармакологическая и оптогенетическая стимуляция нейронов ARC POMC, экспрессирующих TRPV1-подобный рецептор, снижает потребление пищи. Этот анорексигенный эффект блокировался антагонистом MC3 / 4R. Важно отметить, что кратковременное повышение температуры тела быстро передавалось в ARC. Этого повышения гипоталамической температуры было достаточно, чтобы уменьшить потребление пищи, хотя эффекты, не зависящие от температуры, могут объяснить эти анорексигенные эффекты. Мыши, подавляющие ген Trpv1 исключительно в нейронах ARC POMC, не показали влияния повышения гипоталамической температуры на потребление пищи.Таким образом, наши результаты подтверждают интерпретацию, что нейроны ARC POMC обладают способностью реагировать не только на гормоны и питательные вещества, но и на изменения температуры тела.

На первый взгляд, наши текущие результаты экспрессии рецептора TRPV1 могут показаться несовместимыми с результатами предыдущего исследования, описывающего отсутствие экспрессии мРНК Trpv1 в нейронах ARC POMC [17]. Мы думаем, что это, вероятно, связано с методологическими различиями в температурах, применяемых при оценке транскриптома.При изучении типоспецифической транскриптомики клетки POMC-GFP сортировали при комнатной температуре [17]. Важно отметить, что такие субфизиологические температуры снижали экспрессию мРНК Trpv1 и [41]. Таким образом, можно ожидать, что транскриптомная экспрессия рецепторов TRPV1 будет значительно подавлена ​​в таких условиях низких температур; действительно, в наших руках мы обнаружили, что низкотемпературная обработка (т.е. 24 ° C) сильно снижает экспрессию мРНК Trpv1 в нейронах ARC POMC. Мы действительно обнаружили устойчивую мРНК Trpv1 в нейронах ARC POMC, но только при инкубации при температуре в физиологическом диапазоне.

Использование нескольких независимых методов, включая запись патч-кламп, ОТ-ПЦР одиночных клеток, иммуногистохимию, вестерн-блоттинг, нокдаун гена с помощью shRNA, CRISPR / Cas-9-опосредованный нокдаун гена, TRPV1 KOs и TRPV1-Cre мышей. предоставили сходящиеся линии доказательств экспрессии субъединиц рецептора TRPV1 в нейронах ARC POMC. Однако, похоже, что было несоответствие между нашими результатами и предыдущими выводами, описанными в литературе [24,25]. В частности, нейроны ARC POMC были деполяризованы теплой температурой (> 37 ° C).Маловероятно, что эта деполяризация опосредована активацией гомомерных рецепторов TRPV1. Фактически, рекомбинантные рецепторы TRPV1 активировались при гораздо более высоких температурах (> 42 ° C) [4,23]. Эти данные предполагают, что деполяризация, вызванная теплой температурой, может быть следствием активации других каналов, кроме TRPV1, таких как субъединицы TRPV3 и TRPV4, с низкой пороговой температурой [5,6,25,42,43]. Хотя мы не можем исключить эту возможность, чувствительность к капсаицину предполагает, что нейроны ARC POMC содержат субъединицы TRPV1, которые имеют специфический сайт связывания для капсаицина [20–22].

Было документально подтверждено, что каналы TRPV могут собираться в гетеромерные комплексы [23,29,44]. Гетеромерные каналы TRPV, содержащие субъединицы TRPV1, всегда чувствительны к капсаицину, но имеют измененную пороговую температуру [23,44]. Например, гетеромерные каналы TRPV1 / TRPV3 активируются при более низких температурах по сравнению с гомомерными каналами TRPV1 в клетках клеток 293 эмбриональной почки человека (HEK293) (> 34 ° C по сравнению с> 38 ° C) [23], что позволяет предположить, что нейроны ARC POMC могут экспрессировать гетеромерные каналы TRPV.В наших препаратах мРНК Trpv3 и Trpv4 были также обнаружены вместе с транскриптами Trpv1 в нейронах ARC POMC. Интересно, что нейроны в супраоптическом и паравентрикулярном ядрах, экспрессирующие субъединицы рецепторов TRPV1 и TRPV4, возбуждались теплой температурой [13,16,45]. Нейроны в этих областях у мышей TRPV1 KO все еще реагировали на повышенную температуру, хотя амплитуда вызванных температурой токов была значительно снижена [13,16]. В соответствии с этими выводами мы обнаружили, что нокдаун генов Trpv3 и Trpv4 в ARC изменяет тепловую чувствительность.Следовательно, кажется вероятным, что рецепторы TRPV в гипоталамусе обычно образуют гетеромерные, а не гомомерные комплексы, которые имеют чувствительные к капсаицину субъединицы TRPV1 (TRPV1-подобные).

Несмотря на хорошо известные анорексигенные эффекты α-МСГ [46], стимуляция всей популяции ARC POMC не приводила к каноническому снижению потребления пищи [35,36,38]. Отсутствие эффектов селективной стимуляции нейронов ARC POMC может быть частично связано с гетерогенностью нейронов POMC. Большая и постоянно растущая литература поддерживает идею о том, что нейроны ARC POMC нейрохимически, анатомически и функционально неоднородны [19,31,47–51].Например, было показано, что активация нейронов ARC POMC агонистом каннабиноидного рецептора типа 1 способствует потреблению пищи за счет высвобождения опиоидов [31]. В наших препаратах оптогенетическая стимуляция нейронов POMC, экспрессирующих TRPV1, явно снижает потребление пищи. Эти находки предполагают, что нейрохимически и / или нейроанатомически различные субпопуляции нейронов ARC POMC играют разные роли в пищевом поведении. Фактически, хотя агонисты рецепторов TRPV1 и каннабиноидного типа 1 (CB1) деполяризуют нейроны POMC [31], физиологические последствия активации нейронов ARC POMC с помощью TRPV1 по сравнению с агонистами CB1 расходятся в противоположных направлениях.Следовательно, вполне вероятно, что чистый баланс между анорексигенным меланокортином POMC и орексигенными опиоидными POMC нейронами будет точно настраиваться с помощью дифференциальных ответов на связанные с питательными веществами молекулы и передачу сигналов, как описано в нашем предыдущем исследовании [19]. Интересно, что длительная, но не краткосрочная стимуляция нейронов ARC POMC эффективно снижала потребление пищи, и этот анорексигенный эффект полностью отсутствовал у мышей A ^y [36], предполагая, что длительная стимуляция всей популяции нейронов ARC POMC могла действительно сдвигает чистый баланс в сторону оттока анорексигенного меланокортина.

Введение капсаицина снижает потребление пищи и предотвращает увеличение массы тела у грызунов и людей [52,53]. Мыши TRPV1 KO набирали больше массы тела, чем контрольные животные, во взрослом возрасте и на диете с высоким содержанием жиров [54]. Наши настоящие результаты предоставили возможные объяснения того, как ваниллоиды способствуют регуляции пищевого поведения. Другими словами, капсаицин и его аналог возбуждают нейроны POMC, экспрессирующие TRPV1-подобный рецептор, что приводит к снижению потребления пищи. Важно отметить, что TRPV1-подобные рецепторы в нейронах ARC POMC активировались не только ваниллоидами, но и небольшими физиологическими повышениями температуры, которые также могут быть легко вызваны короткими тренировками на беговой дорожке.Следовательно, нейроны POMC, экспрессирующие TRPV1-подобные рецепторы, могут функционировать как преобразователи тепловых стимулов. Подобно гормонам и питательным веществам, вызванная температурой деполяризация нейронов ARC POMC вызвала анорексигенный, меланокортинергический отток нейронов в наших препаратах. В начале 1960-х годов было показано, что активность, связанная с кормлением, приводит к «немедленному» повышению температуры мозга (менее чем за 1 минуту) [55], предполагая, что диета, как и физические упражнения, может повышать температуру гипоталамуса.Поскольку капсаицин увеличивает чувство сытости и насыщения у людей [56], вероятно, что повышенная температура гипоталамуса может способствовать насыщению и, таким образом, уменьшать потребление пищи за счет активации TRPV1-подобных рецепторов в нейронах ARC POMC.

Таким образом, мы идентифицируем меланокортинергический контур, начинающийся в нейронах ARC POMC, который связывает резкое повышение периферической температуры и температуры мозга с резким снижением потребления пищи через активацию TRPV1-подобных рецепторов. Такие механизмы измерения температуры идеально подходят для регулирования потребления и расхода энергии.

Материалы и методы

Заявление об этике

Все процедуры по уходу за мышами и экспериментальные процедуры были одобрены Консультативным комитетом Институциональных исследований по уходу за животными Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (номер протокола: 20150203) и выполнялись в соответствии с руководящими принципами, описанными в руководстве NIH по уходу и использованию лаборатории. животные. Стереотаксические операции и вирусные инъекции проводились под изофлурановой анестезией.

Животные

Все процедуры по уходу за мышами и экспериментальные процедуры были одобрены Консультативным комитетом по исследованиям в области ухода за животными Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна.Мыши, использованные в этих экспериментах, включали мышей POMC-Cre (инвентарный номер 005965), POMC-eGFP (инвентарный номер 009593), TRPV1-Cre (инвентарный номер 017769), мышей CRISPR / Cas-9-eGFP с floxed-stop (инвентарный номер 024857), и TRPV1-KO (инвентарь № 003770, лаборатория Джексона). Использовали как самцов, так и самок мышей смешанного происхождения штаммов C57BL / 6, FVB и 129.

Подготовка срезов и электрофизиологические записи

Поперечные срезы головного мозга получали, как описано в наших предыдущих исследованиях [19]. Срезы уравновешивали насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF) в течение> 1 ч при 32 ° C перед переносом в записывающую камеру.Срезы непрерывно переливали с помощью aCSF со скоростью 1,5 мл / мин, содержащей следующее (в мМ): 113 NaCl, 3 KCl, 1 NaH ₂ PO ₄ , 26 NaHCO ₃ , 2,5 CaCl ₂ , 1 MgCl ₂ и 5 глюкоза в 95% O ₂ /5% CO ₂ .

Все нейрофизиологические записи были получены от ярко флуоресцентных зеленых нейронов, присутствующих у мышей POMC-eGFP, за исключением отмеченных случаев, таких как нейроны POMC-eGFP у мышей POMC-Cre; CRISPR / Cas9. Внутренний раствор содержал следующее (в мМ): 130 K-глюконат, 5 CaCl ₂ , 10 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0.5 Na ₂ GTP и 10 фосфокреатин. Мембранные потенциалы регистрировали в присутствии ионотропного глутамата и антагонистов рецептора GABA _A , таких как CNQX и пикротоксин (10 мкМ и 100 мкМ, соответственно), с помощью Multiclamp 700B. Мембранные токи регистрировали в присутствии ТТХ (500 нМ) и синаптических блокаторов. Электрофизиологические сигналы фильтровались через фильтр нижних частот при 2–5 кГц, сохранялись на ПК и анализировались в автономном режиме с помощью программного обеспечения pClamp 10 (Molecular devices). Для каждой записи мембранные потенциалы, измеренные каждые 30 с, принимались за 1 точку данных.Всего 10 точек данных до и после применения лекарств сравнивались с помощью непарного теста t .

Стереотаксическая хирургия, инфузия лекарств и измерение приема пищи

Мышей содержали под анестезией изофлураном и помещали в стереотаксический аппарат. В асептических условиях стерильные специальные направляющие канюли стереотаксически имплантировали в ARC (AP, -1,2 мм; ML, 0; DV, -5,5 мм) для местной инъекции лекарств (1 мкл 100 нМ капсаицина, Sigma-Aldrich, номер по каталогу M2028 и AMG9810, Tocris bioscience, номер в каталоге 2316) и в боковой желудочек (AP, +0.85 мм; ML, +0,5 мм; DV, -3,0 мм) для инъекции SHU9119 (Tocris bioscience, каталожный № 3420) или налоксона (Tocris bioscience, каталожный № 0599). Животным давали по крайней мере неделю на восстановление после операции. Для измерения потребления пищи животных разделяли по отдельности в отдельные клетки в течение 5 дней и не кормили в течение 6 часов (с 13:00 до 19:00) перед инфузией лекарственного средства. SHU9119 (1 мкл 5 мкМ) или налоксон (1 мкл 1 мМ) вводили интрацеребровентрикулярно за 30 мин до микроинъекции капсаицина или физиологического раствора. Капсаицин и / или AMG9810 вводили непосредственно в ARC в 18:00.Прием пищи измерялся с 19:00 до 23:00 и с 23:00 до 7:00. Мышей, использованных для всех экспериментов, случайным образом распределяли в группу лечения. Для исследований на животных размер выборки оценивался в соответствии с нашим предыдущим опытом [19]. Одиночные мыши с потерей веса 20% были исключены из экспериментов и анализов. Для оптогенетических экспериментов моноволоконная канюля диаметром 230 мкм (Doric Lenses, Inc.) была имплантирована в ARC и соединена с 473-нм лазером DPSS (Laserglow Technologies).

Измерение температуры тела и температуры ARC, а также упражнение на беговой дорожке

Для прямого измерения температуры тела и гипоталамуса, когда мыши бегали на беговой дорожке, проволочный термозонд (IT-24P, Physitemp Instruments) был помещен в ARC (AP, -1,2 мм; ML, 0; DV, -5,5 мм). ) через направляющую канюлю и другой проволочный термозонд (RET-4, Physitemp Instruments) вводили в прямую кишку.

Для упражнений на беговой дорожке (Eco-6M, Columbus Instruments) мышей тренировали бегать на беговой дорожке в течение 2 недель.Мышей всегда прогревали в течение 5 минут со скоростью 7 м / мин, и скорость медленно увеличивали до 18 м / мин. Чтобы измерить потребление пищи после упражнений, животных не кормили с 13:00 до 19:00 и давали жидкую пищу (Ensure original food shake, Abbott). Если в какой-то момент во время эксперимента мышь истощалась, сетка разряда для этой дорожки отключалась, и мыши давали отдохнуть.

shRNA, sgRNA и G

_{i / o} -DREADD вирусная инъекция

Cre-индуцибельный AAV8-hSyn-DIO-hM4D (Gi) -mCherry был приобретен из ядра вектора UNC (200 нл 3 × 10 ¹² БОЕ / мл на сторону).Контроль, Trpv1 , Trpv3 и Trpv4 shRNA лентивирусы были приобретены у Sigma-Aldrich (номер по каталогу SHC012V, 350 нл 1,8 × 10 ⁷ TU / мл на сторону, номер по каталогу SHCLNV-NM_001001445, 500 нл 1,2 × 10 ⁷ TU / мл на сторону, номер по каталогу SHCLNV-NM_145099, 500 нл из 2,6 × 10 ⁷ TU / мл с каждой стороны и номер по каталогу SHCLNV-NM_022017, 1,9 × 10 ⁷ TU / мл на сторона соответственно). Контрольный и Trpv1 лентивирусы sgRNA были приобретены у ABM (каталожный № K019 и каталожный № K4625312, 500 нл 1 × 10 ⁷ МЕ / мл на сторону).Cre-зависимый AAV1-DIO-GFP был приобретен из ядра вектора Пенна (200 нл 1 × 10 ¹³ БОЕ / мл на сторону) и AAV5-nPE-DIO-ChR2-YFP (200 нл 3 × 10 ¹³ БОЕ / мл на сторону) был упакован Vigene Biosciences, Inc. (Роквилл, Мэриленд). Вирусы вводили с двух сторон в ARC (AP, -1,3 мм; ML, ± 0,1 мм; DV, -6,0 мм) POMC-Cre, POMC-Cre :: POMC-GFP, POMC-Cre; CRISPR / Cas-9 -eGFP и мыши TRPV1-Cre. Во время эксперимента исследователи не знали о распределении групп.

Одноклеточная КПЦР после одноклеточной полнотранскриптомной амплификации тотальных РНК от отдельных нейронов ARC POMC

Одноклеточный цельный транскриптом получали с помощью набора для одноклеточной амплификации целого транскриптома REPLI-g (WTA) (Qiagen), как описано ранее [19,47]. Праймеры, использованные для кПЦР, были следующие: F5′-tctatgatcgcaggagcatc-3 ‘и R5′-ggtctttgaactcgctgtca-3’ для Trpv1 (NM_001001445.2), F5′-atttggagtagcgctggcct-3 ‘и Rag5′-atttggagtagcgctggcct-3’ и Rag5 ‘ Трпв3 (NM_145099.2), F5′-ggaccctggcaagagtgaaa-3 ′ и R5′-aggaccaacgatccctacga-3 ′ для Trpv4 (NM_022017.3), F5′-atgccgagattctgctacagt-3 ′ и F5′-tccagcgagaggt-3 ′ 1), а также F5′-gtaacccgttgaaccccatt-3 ‘и R5′-ccatccaatcggtagtagcg-3’ для 18S рРНК (XR_877120.2).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Мышей анестезировали изофлураном и транскардиально перфузировали раствором для предварительной перфузии (9 г NaCl, 5 г нитрата натрия, 1000 ед. Гепарина в 1 л дистиллированной воды).Мозг инкубировали в 4% параформальдегиде в течение ночи в холодной комнате и на следующий день делали срезы с помощью вибратома через 50 мкм. Для иммунофлуоресцентного окрашивания срезы инкубировали в 10 мМ растворе цитрата натрия (pH 9,0) в течение 30 мин при 80 ° C на водяной бане. После извлечения антигена срезы блокировали в 0,1 М буфере PBS, содержащем 0,1% тритона X-100, 5% нормальной козьей сыворотки или нормальной ослиной сыворотки и 5% бычьего сывороточного альбумина в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали с анти- TRPV1 (1: 1000, Alomone Labs, каталожный номер ACC-030), анти-c-fos (1: 500; Abcam, каталожный номер ab7963), анти-GFP (1: 1000, Abcam, каталожный номер ab13970), анти- mCherry (1: 1000, Novus Biologicals, каталожный NBP2-25157) и анти-POMC (1: 1000, Phoenix, каталожный H-029-30 [35]) антитела в течение 72 часов в холодной комнате.Затем срезы промывали 3 раза в PBS и инкубировали с Alexa 568 против кроличьих IgG (1: 500; Life Technologies, номер в каталоге A10042), Alexa 568 против IgG мыши (1: 500; Life Technologies, номер в каталоге A11004), или Alexa 488 против куриных IgG (1: 500, Abcam, каталожный номер ab150169) в течение 2 часов при комнатной температуре. Ткани промывали, сушили и наносили на среду VECTASHIELD, содержащую DAPI. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Leica SP2.

Вестерн-блоттинг

Тотальные лизаты получали из ARC мышей WT, TRPV1-KO и POMC-Cre; CRISPR / Cas9-eGFP, инъецированных с контролем или Trpv1 sgRNA с использованием реагента для лизиса тканей млекопитающих CelLytic (Sigma-Aldrich, номер по каталогу C3228). .Общие лизаты (50 мкг) разделяли на 12% SDS-PAGE гелях и переносили на PVDF-мембрану (Bio-Rad, каталожный № 1620260). Мембрану инкубировали в 5% блокирующем буфере обезжиренного молока в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем инкубировали с анти-TRPV1 (1: 1000, Novus Biologicals, NBP1-97417) и анти-β-актином (1: 5000, Sigma, A5316. ) антитела, разведенные в буфере TBST, содержащем 5% BSA, в течение 24 ч при 4 ° C. После инкубации с первичными антителами мембрану промывали буфером TBST и зондировали антикроличьими IgG, HRP-связанными антителами или антимышиными IgG-связанными антителами (1: 3000, Cell Signaling, каталожный № 7074S и 7076) на предмет выявления 2 ч при комнатной температуре.Все мембраны промывали буфером TBST, инкубировали с хемилюминесцентным субстратом (Cell Signaling, каталожный № 7003) и экспонировали на рентгеновской пленке.

Поколение AAV-нПЭс-ЧР2

Мы субклонировали энхансеры nPE с минимальным промотором гена β-глобина человека. Вектор pAAV-EF1α-double floxed-hChR2 (h234R) -eYFP-WPRE-HGHpA был получен из addgene (плазмида № 20298). Промотор EF1α был заменен геном nPE-глобина. Упаковка AAV была сделана Vigene Biosciences, Inc.(Роквилл, Мэриленд).

Статистика

Статистический анализ выполняли с использованием непарного теста t или однофакторного дисперсионного анализа с тестом множественного сравнения Тьюки (GraphPAD 4.03 и Origin 8.5). Данные считались значимыми, когда значение p было <0,05. Все статистические результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Дополнительная информация

S1 Рис. Нейроны ARC POMC экспрессируют капсаицин-чувствительные рецепторы TRPV1.

(A и B) Типичный образец для регистрации мембранного потенциала до, во время и после обработки агонистом TRPV1.Обработка капсаицином вызывала деполяризацию нейрона POMC. Объединенные данные от 20 нейронов мембранного потенциала нейронов POMC после применения Cap (100 нМ, ΔVm, 3,8 ± 0,5 мВ, *** p <0,001). (C и D) Типичный образец записи, демонстрирующий эффект RTX (C). (D) Объединенные данные мембранного потенциала нейронов POMC после применения RTX (ΔVm, 2,5 ± 1,1 мВ, n = 10 нейронов, * p <0,05). (E и F) Образец записи, показывающий действие антагониста рецептора TRPV1 AMG9810 (10 мкМ) (E).AMG9810 полностью блокировал действие капсаицина ( n = 8 нейронов, p > 0,05) (F). (G и H) Репрезентативная кривая, показывающая деполяризацию нейронов POMC под действием RTX в присутствии TTX (1 мкМ). Объединенные данные мембранного потенциала нейронов POMC после применения RTX (H) ( n = 10 нейронов, p <0,05). Все нейрофизиологические записи были получены от ярко флуоресцентных зеленых нейронов, присутствующих у мышей POMC-eGFP в присутствии пикротоксина (100 мкМ) и CNQX (10 мкМ).Шкала: 20 мВ, 2 мин. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; Кап, капсаицин; CNQX, 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион; eGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; ПОМК, проопиомеланокортин; RTX, резинифератоксин; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1; ТТХ, тетродотоксин.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.s003

(PDF)

S2 Рис. Экспрессия транскриптов

Trpv1 , Trpv3 и Trpv4 в нейронах ARC POMC.

ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; переулок, номер сотового; М — маркер ПЦР; Р — положительный контроль; ПОМК, проопиомеланокортин; Trpv1 , 3 , 4 , переходный рецепторный потенциал ваниллоидных 1, 3, 4 рецепторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.s004

(PDF)

S3 Фиг. Экспрессия мРНК

Trpv1 и в нейронах ARC POMC в различных условиях in vitro.

Верхняя панель: упрощенная структура мРНК (пронумерованные прямоугольники показывают экзоны гена Trpv1 ), кодирующей Trpv1 .Стрелками показаны участки мРНК, обнаруженные наборами праймеров (внешний — синий; внутренний — красный). Гелевые изображения показывают отсутствие мРНК Trpv1 в нейронах ARC POMC из срезов, хранящихся при 24 ° C. M: маркер ПЦР ( Trpv1 , 248 п.н .; Gad2 , 205 п.н .; 18S рРНК , 121 п.н.). P: положительные контрольные образцы одноклеточных клеток были собраны из срезов гипоталамуса, выдержанных при 24 ° C и 36 ° C в течение 3 часов. Первоначальная реакция RT проводилась после выталкивания под давлением одноклеточных образцов в свежеприготовленный раствор RT mix A (20 ЕД РНКазы OUT, 300 нг случайных праймеров, 0.5% NP-40 и вода, свободная от РНКазы). Образцы обрабатывали ультразвуком в общем объеме 10 мкл при 4 ° C в течение 5 мин, а затем инкубировали в течение 3 мин при 65 ° C перед добавлением 10 мкл смеси B для RT (500 мкМ dNTP, 1 × буфер RT, 5 мм MgCl ₂ , 10 мМ DTT и 200 U надстрочного индекса IIl). Пробирки инкубировали при 25 ° C в течение 5 мин, при 42 ° C в течение 1 ч и при 65 ° C в течение 10 мин. Было выполнено три раунда амплификации для обнаружения транскриптов Trpv1 (два раунда с набором внешних праймеров и один цикл с набором внутренних праймеров) и два раунда амплификации для анализа транскриптов Gad2 .Праймеры, используемые для кПЦР, были следующие: Trpv1, внешний праймер , f5′-catgctcattgctctcatgg-3 ′ и r5′-aaccagggcaaagttcttcc-3 ′, внутренний праймер Trpv1 , f5′-catggcgagactgtcaac′-ctgatg- и rgtgtg 3 ′; Gad2, внешний праймер, f5′-ggcgatggaatcttttctcct-3 ‘и Gad2, внутренний праймер f5′-cgcactctggaagacaatga-3′ и r5′-cgaggcgttcgatttcttcaa-3 ‘. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; дНТФ, дезоксинуклеотид; ДТТ, дитиотреитол; Gad2 , глутаматдекарбоксилаза 2; MgCl ₂ , хлорид магния; ПОМК, проопиомеланокортин; RT — обратная транскрипция; Trpv1 , временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1; U, ед.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.s005

(PDF)

S4 Рис. Экспрессия рецепторов TRPV1 в ARC.

(A) Изображение флуоресцентной микроскопии, показывающее экспрессию рецепторов TRPV1 в гипоталамусе. (B) Изображение светлопольной микроскопии, показывающее области (a, b и c), которые были вырезаны для анализа мРНК и вестерн-блоттинга. (C) Относительная экспрессия мРНК Trpv1 и вокруг ARC. Практически не наблюдали экспрессии мРНК Trpv1 в соседних ядрах ARC.Нокдаун гена Trpv1 у мышей, которым инъецировали Trpv1 sgRNA в ARC мышей POMC-Cre ;; CRISPR / Cas9. мРНК от 3 разных мышей объединяли для кПЦР (WT, n = 15 мышей, мыши, которым вводили контрольную sgRNA и Trpv1 sgRNA, n = 6 мышей, соответственно). (D) Изображение вестерн-блоттинга, показывающее отсутствие экспрессии рецепторов TRPV1 вокруг ARC и нокдаун гена Trpv1 в ARC. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; Cre, Cre рекомбиназа; CRISPR / Cas9, кластеры с регулярным расположением коротких палиндромных повторов / CRISPR-ассоциированный белок 9; ПОМК, проопиомеланокортин; КПЦР, количественная полимеразная цепная реакция; sgRNA, одиночная направляющая РНК; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1; WT, дикий тип.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.s006

(PDF)

S5 Рис. Отсутствие экспрессии рецептора TRPV1 в нейронах NPY в ARC.

(A) Изображения флуоресцентной конфокальной микроскопии, показывающие отсутствие экспрессии рецепторов TRPV1 в нейронах NPY. Масштабная линейка: 20 мкм. (B и C) Типичный образец записи, показывающий отсутствие ответа нейронов NPY на RTX (100 нМ). Шкала: 25 мВ, 1 мин. Объединенные данные среднего мембранного потенциала от 10 нейронов NPY-GFP (C, Vm, контроль, -60.8 ± 0,7 мВ; RTX, -63,0 ± 1,6 мВ, n = 10 нейронов, p > 0,05). Все данные представлены как среднее ± SEM. (D и E) Образец записи, показывающий, что повышение температуры не изменяет мембранный потенциал нейронов NPY-GFP. Объединенные данные от 5 нейронов NYP-GFP (E). Шкала шкалы: 20 мВ, 10 с. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; GFP, зеленый флуоресцентный белок; NPY, нейропептид Y; RTX, резинифератоксин; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.s007

(PDF)

S6 Рис. Экспрессия рецептора TRPV1 в нейронах POMC в ARC.

(A и B) Репрезентативная кривая, показывающая реакцию нейронов POMC на повышение температуры с 34 ° C до 38 ° C. Нокдаун гена Trpv1 в нейронах POMC уменьшал среднюю амплитуду чувствительных к температуре внутренних токов (температура с 34 ° C до 38 ° C; контроль, -15,7 ± 3,1 пА, n = 11 нейронов; Trpv1 sgRNA , −6.1 ± 1,4 пА, n = 6 нейронов, p <0,05). Удерживающий потенциал −70 мВ, шкала: 50 пА, 50 с. (C) Опосредованная температурой деполяризация нейрона POMC, показанная на фиг. 1F, была полностью обратимой при понижении температуры. Температурно-чувствительные нейроны POMC также ответили на агонист рецептора TRPV1 RTX (100 нМ). Шкала шкалы: 50 мВ, 5 мин. (D и E) Нечувствительные к температуре нейроны POMC не ответили на RTX. Объединенные данные о среднем мембранном потенциале нечувствительных к температуре нейронов POMC при 34 ° C и 38 ° C ( n = 7 нейронов).Шкала шкалы: 50 мВ, 5 мин. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; ПОМК, проопиомеланокортин; RTX, резинифератоксин; sgRNA, одиночная направляющая РНК; TRPV1, временный рецепторный потенциал ваниллоидного рецептора 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.s008

(PDF)

S7 Рис. Измененная тепловая чувствительность нейронов POMC после нокдауна генов

Trpv3 и Trpv4 в ARC.

(A) Репрезентативный след записи патч-клампа целых клеток нейронов POMC от мышей, которым вводили кшРНК Trpv3 и Trpv4 в ARC.Шкала шкалы, 20 мВ, 2 мин. (B) Объединенные данные от 7 нейронов POMC от мышей, которым инъецировали Trpv3 и Trpv4 shRNA в ARC. В отличие от результатов на контрольных мышах (рис. 1G), нейроны POMC были менее чувствительны к повышенной температуре в этих экспериментальных условиях. * p <0,05. ARC, дугообразное ядро ​​гипоталамуса; ПОМК, проопиомеланокортин; shRNA, короткая шпилечная РНК; Trpv3 , временный рецепторный потенциал ваниллоидного 3 рецептора, Trpv4 , временный рецепторный потенциал ваниллоидного 4 рецептора.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.s009

(PDF)

S1 Данные. Все индивидуальные числовые значения, лежащие в основе сводных данных, показаны на следующих рисунках: Рис. 1G, 1H, 2C, 2D, 2F, 2G, 2H, 3B, 3C, 3D, 3E, 4D, 4F, 5D, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F и 6G, S1B, S1D, S1F, S1H, S4C, S5C, S5E, S6B, S6E, S7B и S8 Рис.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004399.s012

(XLSX)

Ссылки

1. 1. Бейкер ФК, Ванер Джи, Виейра Э.Ф., Тейлор С.Р., Драйвер Х.С., Митчелл Д.Сон и суточная температура тела: сравнение у молодых мужчин, женщин, ведущих естественный цикл, и женщин, принимающих гормональные контрацептивы. J Physiol. 2001; 530 (Pt 3): 565–74. pmid: 11158285.
2. 2. Schlader ZJ, Stannard SR, Mundel T. Терморегуляторное поведение человека во время отдыха и физических упражнений — перспективный обзор. Physiol Behav. 2010. 99 (3): 269–75. pmid: 20006632.
3. 3. Хиби М., Оиси С., Мацусита М., Йонеширо Т., Ямагути Т., Усуи С. и др. Коричневая жировая ткань участвует в термогенезе, вызванном диетой, и в утилизации жира всего тела у здоровых людей.Int J Obes (Лондон). 2016; 40 (11): 1655–61. pmid: 27430878 Кацураги — сотрудники корпорации Kao. У других авторов нет личных или финансовых конфликтов интересов.
4. 4. Катерина MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. Рецептор капсаицина: активируемый нагреванием ионный канал в болевом пути. Природа. 1997. 389 (6653): 816–24. pmid: 9349813.
5. 5. Smith GD, Gunthorpe MJ, Kelsell RE, Hayes PD, Reilly P, Facer P и др. TRPV3 — это чувствительный к температуре ваниллоидный рецептор-подобный белок.Природа. 2002. 418 (6894): 186–90. pmid: 12077606.
6. 6. Xu H, Ramsey IS, Kotecha SA, Moran MM, Chong JA, Lawson D, et al. TRPV3 представляет собой проницаемый для кальция термочувствительный катионный канал. Природа. 2002. 418 (6894): 181–6. pmid: 12077604.
7. 7. Patapoutian A, Peier AM, Story GM, Viswanath V. Каналы ThermoTRP и за их пределами: механизмы температурного ощущения. Nat Rev Neurosci. 2003. 4 (7): 529–39. pmid: 12838328.
8. 8. Ахлувалия Дж., Ранг Х., Надь И.Предполагаемая роль ваниллоидного рецептора-подобного протеина-1 в обеспечении высокой пороговой чувствительности к вредным температурам в культивируемых крысами первичных сенсорных нейронах. Eur J Neurosci. 2002. 16 (8): 1483–149. pmid: 12405961.
9. 9. Todaka H, ​​Taniguchi J, Satoh J, Mizuno A, Suzuki M. Теплый термочувствительный переходный рецепторный потенциал ваниллоида 4 (TRPV4) играет важную роль в тепловой гипералгезии. J Biol Chem. 2004. 279 (34): 35133–8. pmid: 15187078.
10. 10. Накаяма Т., Эйзенман Дж. С., Харди Дж. Д..Единичная активность переднего гипоталамуса при локальном нагревании. Наука. 1961. 134 (3478): 560–1. pmid: 13727681.
11. 11. Mezey E, Toth ZE, Cortright DN, Arzubi MK, Krause JE, Elde R, et al. Распределение мРНК для ваниллоидного рецептора подтипа 1 (VR1) и VR1-подобная иммунореактивность в центральной нервной системе крысы и человека. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97 (7): 3655–60. pmid: 10725386.
12. 12. Cavanaugh DJ, Chesler AT, Jackson AC, Sigal YM, Yamanaka H, ​​Grant R и др.Мыши-репортеры Trpv1 обнаруживают сильно ограниченное распределение в мозге и функциональную экспрессию в клетках гладких мышц артериол. J Neurosci. 2011; 31 (13): 5067–77. pmid: 21451044.
13. 13. Садбери-младший, Бурк CW. Динамическая и разрешающая роль каналов TRPV1 и TRPV4 для термочувствительности в супраоптических магноцеллюлярных нейросекреторных нейронах мыши. J Neurosci. 2013. 33 (43): 17160–5. pmid: 24155319.
14. 14. Робертс Дж. К., Дэвис Дж. Б., Benham CD. [3H] Авторадиография резинифератоксина в ЦНС мышей дикого типа и мышей без TRPV1 определяет распределение белка TRPV1 (VR-1).Brain Res. 2004. 995 (2): 176–83. pmid: 14672807.
15. 15. Шариф Наейни Р., Витти М.Ф., Сегела П., Бурк CW. N-концевой вариант канала Trpv1 необходим для осмосенсорной трансдукции. Nat Neurosci. 2006; 9 (1): 93–8. pmid: 16327782.
16. 16. Шариф-Наейни Р., Чура С., Бурк CW. Ген TRPV1, необходимый для термосенсорной трансдукции и упреждающей секреции нейронов вазопрессина во время гипертермии. Нейрон. 2008. 58 (2): 179–85. pmid: 18439403.
17. 17.Генри Ф. Е., Сугино К., Тозер А., Бранко Т., Стернсон С. М.. Клеточно-специфическая транскриптомика энергочувствительных нейронов гипоталамуса в ответ на потерю веса. Элиф. 2015; 4. pmid: 26329458.
18. 18. Acuna-Goycolea C, van den Pol AN. Нейроэндокринные нейроны проопиомеланокортина возбуждаются гипокретином / орексином. J Neurosci. 2009. 29 (5): 1503–13. pmid: 19193897.
19. 19. Ли Д.К., Чон Дж. Х., Чун С. К., Чуа С. младший, Чо Ю. Взаимодействие между передачей сигналов глюкозы и лептина определяет силу ГАМКергических синапсов в нейронах POMC.Nat Commun. 2015; 6: 6618. pmid: 25808323.
20. 20. Джордт С.Е., Джулиус Д. Молекулярная основа видоспецифической чувствительности к «острым» перцам чили. Клетка. 2002. 108 (3): 421–30. pmid: 11853675.
21. 21. Ян Ф, Сяо X, Ченг В., Ян В., Ю П, Сон Зи и др. Структурный механизм, лежащий в основе связывания капсаицина и активации ионного канала TRPV1. Nat Chem Biol. 2015; 11 (7): 518–24. pmid: 26053297.
22. 22. Ян Ф, Чжэн Дж. Поймите пряность: механизм активации канала TRPV1 капсаицином.Белковая клетка. 2017; 8 (3): 169–77. pmid: 28044278.
23. 23. Cheng W, Yang F, Liu S, Colton CK, Wang C, Cui Y и др. Гетеромерные термочувствительные переходные потенциальные каналы рецепторов демонстрируют отчетливую температурную и химическую реакцию. J Biol Chem. 2012. 287 (10): 7279–88. pmid: 22184123.
24. 24. Катерина MJ, Джулиус Д. Ваниллоидный рецептор: молекулярные ворота в путь боли. Annu Rev Neurosci. 2001; 24: 487–517. pmid: 11283319.
25. 25. Кауэр Дж. А., Гибсон Х. Э.Горячая вспышка: каналы TRPV в мозгу. Trends Neurosci. 2009. 32 (4): 215–24. pmid: 19285736.
26. 26. Vriens J, Appendino G, Nilius B. Фармакология ваниллоидных временных каналов катионов рецептора. Mol Pharmacol. 2009. 75 (6): 1262–79. pmid: 19297520.
27. 27. Raisinghani M, Pabbidi RM, Premkumar LS. Активация временного рецепторного потенциала ваниллоида 1 (TRPV1) резинифератоксином. J Physiol. 2005; 567 (Pt 3): 771–86. pmid: 16037081.
28. 28. Гавва Н.Р., Тамир Р., Ку Й., Клионски Л., Чжан Т.Дж., Иммке Д. и др.AMG 9810 [(E) -3- (4-трет-бутилфенил) -N- (2,3-дигидробензо [b] [1,4] диоксин-6-ил) акриламид], новый ваниллоидный рецептор 1 (TRPV1) антагонист с антигипералгезическими свойствами. J Pharmacol Exp Ther. 2005. 313 (1): 474–84. pmid: 15615864.
29. 29. Cheng W, Yang F, Takanishi CL, Zheng J. Термочувствительные субъединицы TRPV-канала объединяются в гетеромерные каналы с промежуточной проводимостью и стробирующими свойствами. J Gen Physiol. 2007. 129 (3): 191–207. pmid: 17325193.
30. 30. Лам Д.Д., Аттард, Калифорния, Мерсер А.Дж., Майерс М.Г. мл., Рубинштейн М, Лоу MJ. Условная экспрессия Pomc в Lepr-позитивной субпопуляции нейронов POMC достаточна для нормального энергетического гомеостаза и метаболизма. Эндокринология. 2015. 156 (4): 1292–302. pmid: 25594696.
31. 31. Кох М., Варела Л., Ким Дж. Г., Ким Дж. Д., Эрнандес-Нуно Ф., Саймондс С. Е. и др. Гипоталамические нейроны POMC способствуют питанию, индуцированному каннабиноидами. Природа. 2015; 519 (7541): 45–50. pmid: 25707796.
32. 32. Бумащный В.Ф., Ямашита М., Касас-Кордеро Р., Отеро-Корчон В., де Соуза Ф.С., Рубинштейн М. и др.Мышей с запрограммированным ожирением спасают с помощью раннего генетического вмешательства. J Clin Invest. 2012. 122 (11): 4203–12. pmid: 23093774.
33. 33. Plum L, Ma X, Hampel B, Balthasar N, Coppari R, Munzberg H и др. Усиленная передача сигналов PIP3 в нейронах POMC вызывает активацию канала KATP и приводит к ожирению, чувствительному к диете. J Clin Invest. 2006. 116 (7): 1886–901. pmid: 16794735.
34. 34. Хилл Дж. У., Уильямс К. В., Йе С., Ло Дж., Бальтазар Н., Коппари Р. и др. Острые эффекты лептина требуют передачи сигналов PI3K в нейронах гипоталамуса проопиомеланокортина у мышей.J Clin Invest. 2008. 118 (5): 1796–805. pmid: 18382766.
35. 35. Zhan C, Zhou J, Feng Q, Zhang JE, Lin S, Bao J и др. Острое и долгосрочное подавление пищевого поведения нейронами POMC в стволе мозга и гипоталамусе соответственно. J Neurosci. 2013. 33 (8): 3624–32. pmid: 23426689.
36. 36. Апонте Ю., Атасой Д., Стернсон С.М. Нейронов AGRP достаточно, чтобы управлять пищевым поведением быстро и без обучения. Nat Neurosci. 2011; 14 (3): 351–5. Epub 2011/01/07.pmid: 21209617.
37. 37. Энриори П.Дж., Эванс А.Е., Синнаях П., Джобст Е.Е., Тонелли-Лемос Л., Биллес С.К. и др. Ожирение, вызванное диетой, вызывает тяжелую, но обратимую резистентность к лептину в дугообразных нейронах меланокортина. Cell Metab. 2007. 5 (3): 181–94. pmid: 17339026.
38. 38. Фенселау Х., Кэмпбелл Дж. Н., Верстеген А. М., Мадара Дж. К., Сюй Дж., Шах Б. П. и др. Быстро действующий глутаматергический контур насыщения ARC-> PVH постсинаптически регулируется альфа-MSH. Nat Neurosci. 2017; 20 (1): 42–51.pmid: 27869800.
39. 39. de Souza FS, Santangelo AM, Bumaschny V, Avale ME, Smart JL, Low MJ, et al. Идентификация нейрональных энхансеров гена проопиомеланокортина с помощью анализа трансгенных мышей и филогенетического следа. Mol Cell Biol. 2005. 25 (8): 3076–86. pmid: 15798195.
40. 40. Фонсека К.Г., Пирес В., Лима М.Р., Гимарайнш Дж.Б., Лима Н.Р., Ваннер С.П. Гипоталамическая температура крыс, бегающих на беговой дорожке в холодной среде. PLoS ONE. 2014; 9 (11): e111501.pmid: 25365556.
41. 41. Биллетер А.Т., Гэлбрейт Н., Уокер С., Лоусон С., Гарднер С.А., Сароджини Н. и др. TRPA1 опосредует эффекты гипотермии на воспалительную реакцию моноцитов. Операция. 2015. 158 (3): 646–54. pmid: 26054320.
42. 42. Чжэн Дж. Молекулярный механизм TRP-каналов. Compr Physiol. 2013; 3 (1): 221–42. pmid: 23720286.
43. 43. Гулер А.Д., Ли Х., Иида Т., Симидзу И., Томинага М., Катерина М. Активация ионного канала, вызванная теплом, TRPV4.J Neurosci. 2002. 22 (15): 6408–14. pmid: 12151520.
44. 44. Hellwig N, Albrecht N, Harteneck C, Schultz G, Schaefer M. Гомо- и гетеромерная сборка субъединиц TRPV-канала. J Cell Sci. 2005; 118 (Pt 5): 917–28. pmid: 15713749.
45. 45. Недунгади Т.П., Каррено ФР, Уолч Д.Д., Батина К.С., Каннингем Дж. Т.. Регион-специфические изменения в экспрессии транзиторного рецепторного потенциала ваниллоидного канала в магноцеллюлярной системе вазопрессина при гипонатриемии, вызванной циррозом печени.J Neuroendocrinol. 2012. 24 (4): 642–52. pmid: 22188460.
46. 46. Андерсон EJ, Cakir I, Carrington SJ, Cone RD, Ghamari-Langroudi M, Gillyard T. и др. 60 ЛЕТ POMC: Регулирование гомеостаза питания и энергии с помощью альфа-МСГ. J Mol Endocrinol. 2016; 56 (4): T157–74. pmid: 26939593.
47. 47. Jeong JH, Woo YJ, Chua S Jr., Jo YH. Анализ экспрессии одноклеточных генов холинергических нейронов в дугообразном ядре гипоталамуса. PLoS ONE. 2016; 11 (9): e0162839.pmid: 27611685.
48. 48. Элиас К.Ф., Ашкенази С., Ли К., Келли Дж., Ахима Р.С., Бьорбек С. и др. Лептин по-разному регулирует нейроны NPY и POMC, проецирующиеся в латеральную область гипоталамуса. Нейрон. 1999. 23 (4): 775–86. pmid: 10482243.
49. 49. Элиас К.Ф., Ли С., Келли Дж., Ашкенази С., Ахима Р.С., Коусейро П.Р. и др. Лептин активирует нейроны гипоталамической КОРЗИНЫ, проецирующиеся в спинной мозг. Нейрон. 1998. 21 (6): 1375–85. pmid: 9883730.
50. 50. King CM, Hentges ST.Относительное количество и распределение нейронов гипоталамического проопиомеланокортина мышей, иннервирующих отдельные участки-мишени. PLoS ONE. 2011; 6 (10): e25864. pmid: 21991375.
51. 51. Хентжес СТ, Отеро-Корчон V, Пеннок Р.Л., Кинг С.М., Лоу MJ. Экспрессия проопиомеланокортина в нейронах ГАМК и глутамата. J Neurosci. 2009. 29 (43): 13684–90. pmid: 19864580.
52. 52. Zhang LL, Yan Liu D, Ma LQ, Luo ZD, Cao TB, Zhong J, et al. Активация временного рецепторного потенциала ваниллоидного канала типа 1 предотвращает адипогенез и ожирение.Circ Res. 2007. 100 (7): 1063–70. pmid: 17347480.
53. 53. Уайтинг С., Дербишир Э, Тивари Б.К. Капсаициноиды и капсиноиды. Потенциальная роль в управлении весом? Систематический обзор доказательств. Аппетит. 2012; 59 (2): 341–8. pmid: 22634197.
54. 54. Ли Э, Юнг Д. Ю., Ким Дж. Х., Патель П. Р., Ху Х, Ли Й и др. Ваниллоидный канал типа 1 с временным рецепторным потенциалом регулирует вызванное диетой ожирение, инсулинорезистентность и лептиновую резистентность. FASEB J. 2015. pmid: 25888600.
55. 55. Рэмпоне Эй Джей, Ширасу МЭ. Изменение температуры крысы в ​​ответ на кормление. Наука. 1964; 144 (3616): 317–9. pmid: 14169727.
56. 56. Janssens PL, Hursel R, Westerterp-Plantenga MS. Капсаицин увеличивает ощущение наполнения энергетического баланса и снижает желание есть после обеда при отрицательном энергетическом балансе.